文章简介
高效液相色谱法测定透明质酸中的EDA
高效液相色谱法测定透明质酸中的EDTA
耿小锋，高明，徐艳林，李明慧
(华勤橡胶工业集团 研发实验室，山东，兖州 272100)
摘 要: 建立以高效液相色谱法测定透明质酸中EDTA含量的方法，采用ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 ×150 mm,5µm）色谱柱，以乙腈：10%四丁基氢氧化铵(PH:6.5)：水=20:20:60为流动相，流速1.0ml/min，检测波长260nm，采用外标法定量。该方法在 0.0372 µg/ml -1.86 µg/ml浓度范围内线性关系良好(R2=0.9998)，对透明质酸样品中EDTA的检测限为0.004745µg/g，定量限为0.01424µg/g，样品加标回收率为87.2% ~ 93.6%，相对标准偏差小于5.0%。能够满足透明质酸样品中EDTA检测的需要。
关键词：高效液相色谱；透明质酸；EDTA
透明质酸（HA）是由β- D -葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D -氨基葡萄糖通过β- 1, 3 - 苷键连接成二糖衍生物，并以此为重复单元再通过β - 1, 4 - 苷键互相连接成一种酸性粘多糖类物质[ 1]。它是人体内分布最广的一种酸性黏多糖，存在于结缔组织基质中，以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多重的生理功能）[ 2]。在化妆品、保健食品、美容手术等医疗领域得到广泛的应用[ 3-4]。由于透明质酸具有良好的保湿作用，目前已广泛用于化妆品中，被誉为理想的天然保湿因子[ 5]。添加HA的化妆品也已成为国际日化界的主流产品[6 - 7 ]。透明质酸生产工艺中添加的乙二胺四乙酸是一种强络合剂，主要用作螯合剂、防腐剂、抗氧化增效剂。在透明质酸中EDTA会与金属离子络合, 形成稳定的络合物, 可防止其变质[8]，但EDTA 对人体有害, 国外对EDTA 在食品中的残留量有限量规定[ 9]。测定不同样品中EDTA 的方法有分光光度法[10-11]、滴定法和高效液相色谱法[ 12-15]、电化学分析法 [16]， 滴定法和比色法很难将EDTA 络合物和其他络合物区分, 测定结果不能令人满意；高效液相色谱法一般通过检测EDTA 的金属络合物EDTA-Fe或EDTA-Cu 对EDTA 进行测定[ 17-19]。本文通过测定EDTA-Fe来确定透明质酸中EDTA的残留量，控制透明质酸的质量。
1.实验部分
1.1 仪器与试剂
高效液相色谱仪（Agilent Technologies1200）、电子天平（METTLER TOLEDO XS104）、超纯水仪（Millipore Advantage A10 ）、振荡器（江苏正基仪器有限公司）、超声波清洗器（昆山超生仪器有限公司 KQ-300VED）、反相色谱柱（ZORBAX Eclipse XDB-C18）。
EDTA对照品（天津市化学试剂研究所）、乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）、10%四丁基氢氧化铵（分析纯，天津市化工研究所）、EDTA
标准溶液（0.05mol/ml,天津市新纯化学试剂研究所）、盐酸（分析纯，国药集团试剂有限公司）、FeCl3 （分析纯，山东莱州试剂有限公司）。透明质酸样品为市售样品。
1.2色谱条件
色谱柱ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 ×150mm，5µm）；流动相：乙腈：10%四丁基氢氧化铵(pH6.5)：水=20：20：60；流速1.0ml/ml；检测波长：260nm；柱温30℃；进样量为10µl。
1.3 标准溶液的制备
稀释EDTA标准溶液（0.05mol/ml），得到浓度分别为1.86 µg/ml 、0.744 µg/ml、0.372 µg/ml、0.186 µg/ml、0.0744 µg/ml、0.0372 µg/ml的工作标准溶液。用工作标准溶液建立标准曲线，由保留时间定性，根据工作标准液的浓度及响应峰面积，外标法定量。
1.4 样品溶液的制备
精确称取0.05g样品转移至100ml容量瓶中，加入80ml超纯水，于振荡器上振荡15分钟，透明质酸样品全部溶解后，定容。移取8ml样品溶液至50ml烧杯中，加入2ml的FeCl3-HCl溶液，在磁力搅拌器上搅拌均匀后，停放5min。用0.45 µm微孔滤膜过滤后进样分析。
2、结果与讨论
2.1样品处理条件的选择
配制一定浓度的EDTA标准溶液进样分析，得到的色谱图中，EDTA吸收峰较小，灵敏度低。EDTA易与高效液相色谱系统中的不锈钢管路表面发生络合，腐蚀管路，因此先加入络合剂将EDTA络合后再进行试验。用1%硫酸铜溶液与EDTA络合后进样分析，所得色谱图基线漂移严重，EDTA无法定量。利用三氯化铁与EDTA络合后进样分析，所得样品色谱图中基线平稳，EDTA目标峰吸收强度明显增加，目标峰附近无杂质干扰峰。因此选择在透明质酸样品溶液中加入一定量的FeCl3溶液络合后在进样分析。
2.2检测波长的选择
EDTA与FeCl3络合后的溶液经紫外分光光度计扫描，在240nm-270nm范围内都有较大的吸收。实验发现当选择260nm为检测波长时测定灵敏度较高且色谱峰分离较好，所以选择260nm为检测波长。
2.3 流动相体系的选择
以0.03mol/L四丁基溴化铵的醋酸缓冲溶液（pH4.0）-甲醇为流动相体系，流动相的配比分别为60：40；80：20；90：10时，EDTA目标峰保留时间均在1.5min左右，与其它杂质分离效果差，影响定量的准确性。以乙腈：10%四丁基氢氧化铵缓冲溶液（pH6.5)：水=20：20：60为流动相，EDTA目标峰保留时间为4.8min，EDTA目标物与其他杂质得到很好的分离。图1和图2分别该流动相体系下透明质酸样品溶液和EDTA标准溶液分离色谱图。
图1 透明质酸样品色谱图
图2 EDTA标准溶液色谱图
2.4 标准曲线、检出限和定量限
按色谱条件对1.3工作标准溶液进样HPLC分析，测得不同浓度标准溶液的峰面积响应值。并以EDTA标准溶液的浓度（y）为纵坐标，EDTA峰面积（x，mAU）为横坐标，建立标准曲线并得回归方程及相关系数。结果表明在0.0372 µg/ml ~ 1.86 µg/ml 浓度范围线性良好，回归线性方程为：y=0.566x+0.0207（R2=0.9998）。按照信噪比即S/N=3得到该方法对EDTA的检测限为0.004745µg/ml。同时以10倍信噪比得到该方法对EDTA的定量限为0.01424µg/ml，线性关系、检出限及定量限见表1。
2.5 方法的回收率及精密度
对3个实际样品分别添加不同质量水平的1.86µg/mEDTA标准样品，按照上述样品处理方法和色谱条件进行实验，计算EDTA添加回收率以及测定结果的相对标准偏差，回收率结果见表2，EDTA-Fe的回收率是87.2%-93.6%，相对标准偏差均小于5%。
2.6 样品测定
在上述实验条件下，测定了不同批次的同一厂家的透明质酸，测定结果见表3。
3结论
本文采用高效液相色谱法测定了透明质酸中EDTA含量。对样品的前络合、流动相和检测波长等进行了选择和探索。该方法操作简便快捷，结果准确，稳定性好。为透明质酸中EDTA含量检测提供一种快速准确有效的方法。
表1 线性回归方程及检出限、定量限
Table 1 linear regression equations , detection and quantification limits
高效液相色谱法测定透明质酸中的EDTA
耿小锋，高明，徐艳林，李明慧
(华勤橡胶工业集团 研发实验室，山东，兖州 272100)
摘 要: 建立以高效液相色谱法测定透明质酸中EDTA含量的方法，采用ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 ×150 mm,5µm）色谱柱，以乙腈：10%四丁基氢氧化铵(PH:6.5)：水=20:20:60为流动相，流速1.0ml/min，检测波长260nm，采用外标法定量。该方法在 0.0372 µg/ml -1.86 µg/ml浓度范围内线性关系良好(R2=0.9998)，对透明质酸样品中EDTA的检测限为0.004745µg/g，定量限为0.01424µg/g，样品加标回收率为87.2% ~ 93.6%，相对标准偏差小于5.0%。能够满足透明质酸样品中EDTA检测的需要。
关键词：高效液相色谱；透明质酸；EDTA
透明质酸（HA）是由β- D -葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D -氨基葡萄糖通过β- 1, 3 - 苷键连接成二糖衍生物，并以此为重复单元再通过β - 1, 4 - 苷键互相连接成一种酸性粘多糖类物质[ 1]。它是人体内分布最广的一种酸性黏多糖，存在于结缔组织基质中，以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多重的生理功能）[ 2]。在化妆品、保健食品、美容手术等医疗领域得到广泛的应用[ 3-4]。由于透明质酸具有良好的保湿作用，目前已广泛用于化妆品中，被誉为理想的天然保湿因子[ 5]。添加HA的化妆品也已成为国际日化界的主流产品[6 - 7 ]。透明质酸生产工艺中添加的乙二胺四乙酸是一种强络合剂，主要用作螯合剂、防腐剂、抗氧化增效剂。在透明质酸中EDTA会与金属离子络合, 形成稳定的络合物, 可防止其变质[8]，但EDTA 对人体有害, 国外对EDTA 在食品中的残留量有限量规定[ 9]。测定不同样品中EDTA 的方法有分光光度法[10-11]、滴定法和高效液相色谱法[ 12-15]、电化学分析法 [16]， 滴定法和比色法很难将EDTA 络合物和其他络合物区分, 测定结果不能令人满意；高效液相色谱法一般通过检测EDTA 的金属络合物EDTA-Fe或EDTA-Cu 对EDTA 进行测定[ 17-19]。本文通过测定EDTA-Fe来确定透明质酸中EDTA的残留量，控制透明质酸的质量。
1.实验部分
1.1 仪器与试剂
高效液相色谱仪（Agilent Technologies1200）、电子天平（METTLER TOLEDO XS104）、超纯水仪（Millipore Advantage A10 ）、振荡器（江苏正基仪器有限公司）、超声波清洗器（昆山超生仪器有限公司 KQ-300VED）、反相色谱柱（ZORBAX Eclipse XDB-C18）。
EDTA对照品（天津市化学试剂研究所）、乙腈（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）、10%四丁基氢氧化铵（分析纯，天津市化工研究所）、EDTA
|
组分 |
线性方程（n=6） |
相关系数 |
检出限µg/ml |
定量限µg/ml |
|
EDTA |
y=0.566x+0.0207 |
0.9998 |
0.004745 |
0.01424 |
表2 回收率的测试结果（n=5）
Table 2 results of recovery
|
样号 |
本底值w/(µg/g) |
标准加入量/（µg/g） |
测定总量w（µg/g） |
回收率/% |
RSD/% |
|
1 |
121.28 |
59.
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