摘要：手性化合物的分离在制药、食品及化妆品等领域至关重要，其中基于手性固定相的高效液相色谱法因其直接、高效的特点成为主流技术。在众多手性固定相中，多糖类固定相，特别是纤维素和直链淀粉的苯基氨基甲酸酯衍生物，因其能够解决约90%的手性分离问题而占据主导地位。本文重点总结了多糖手性固定相的合成以及固定化的方法、识别机理及在高效液相色谱上的最新应用。同时在文章最后也对超临界流体方面的应用进行比较。另外，为实现快速分析，采用表面多孔硅胶和整体柱等新型填料已成为重要趋势。有关多糖手性固定相的未来发展方向，主要还是集中在新型固定相的研发，固定化方法的优化，以及分子水平的识别机理的研究和有效的多糖手性柱评价体系的建立等等。
关键词：多糖手性固定相；合成；固定化；识别机理；应用
中图分类号：O657.7
引 言
1848年，路易·巴斯德在研究外消旋酒石酸时发现，有些晶体的外部形态在显微镜下表现出“右旋”形态，而另一些则表现为“左旋”，两种形态的酒石酸呈现出相反的旋光性[1]。这一发现为后来范特霍夫和勒贝尔建立“理论模型”提供了基础，他们指出连接在碳原子上四个不同基团的排列方式是分子具有手性的原因。1884年，开尔文勋爵将“手性”一词引入科学领域，此后，人们发现手性是一种自然现象，广泛存在于动植物界中。
手性化合物中，具有相同分子式，但以镜像形式存在，不能相互叠加的一对异构体，我们将其称为“对映异构体”，按照其手性碳原子上取代基的排列方式不同，分为左旋（S）和右旋（R）两种构型。一对对映体的不同构型可能具有不同的药理学性质，因此手性分析在药理学中备受关注。比如一种构型的对映异构体有治疗作用，而另一种无活性或可能含有毒性。二十世纪六十年代初，一种用于减轻孕吐的药物“沙利度胺”在全球范围内引起了严重的药害事件，有超过15000名新生儿畸形。进一步研究表明，沙利度胺是一对对映异构体，其右旋体具有镇静作用，而左旋体则具有致畸性。此次事件之后，美国FDA出台相关法案大幅加强药品监管，建立了严格的药物上市前审批和上市后监测体系。1992年美国FDA发布的政策声明中明确规定手性新药必须给出每种异构体的药效药动学研究结果，如果两种对映异构体的药效存在明显差异，则必须以光学纯的形式上市。2006年，我国药品监管部门也出台了相应政策。
手性分子分析工作不仅在药学领域至关重要，在其他领域，比如医学、食品、化妆品、聚合物和分子生物学等，也有重要研究价值[2]。然而手性化合物的物理和化学性质相似，如何有效的分离纯化光学纯的对映异构体一直是科学家探讨的课题。目前，对于对映异构体的分离纯化，已有不少分析和制备的方法[3]，如非对映异构体结晶、气相色谱（GC）、纳米液相色谱（nano-LC）和高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳（CE）、超临界流体色谱（SFC）等[4-6]。HPLC是其中最常规的分离和制备技术，它既可以用手性衍生化试剂与对映异构体反应，生成非对映异构体后实现间接分离，也可用含有手性固定相的色谱柱直接分离。由于衍生化是分离过程中的额外步骤，有时合适的衍生化试剂并不好找，同时还需要考虑衍生化试剂的纯度、涉及的副反应、反应过程中可能发生的外消旋化等，所以间接分离法并不实用。相反，基于手性固定相的直接分离法，则有简便、高灵敏度和重现性等优势，是分析手性化合物的首选方法。因此，手性固定相的研发、合成、评价以及分离机理成为手性分析的重要方向。
目前，许多科学团队开发了几类手性固定相并证明了在对映异构体分离中的有效性，这些固定相包括多糖、大环抗生素、环糊精、冠醚、蛋白质和刷型等[7-9]。其中，多糖手性固定相在手性分析中的应用最为广泛，可以解决90%的对映异构体分离问题[10,11]。本篇综述主要对多糖手性固定相的合成、固定化和表征方法、分离机理以及最新应用进行总结。
1 多糖手性固定相
多糖手性固定相主要包括纤维素和直链淀粉衍生物。纤维素和直链淀粉是自然界中天然的光学活性高分子，其本身的手性识别能力较低，通常需要对葡萄糖单元的2,3,6-位羟基进行取代，得到多糖衍生物，取代后的多糖衍生物手性识别能力往往大大增加，具有更广泛的应用价值。1973年，Hesse和Hagel报道了第一个合成的多糖手性选择剂——纤维素三醋酸酯（CTA）[12]。1984年，Okamoto的团队将纤维素三苯甲酸酯等多糖衍生物涂敷在硅胶表面形成手性固定相，这些固定相与CTA相比具有更好的手性识别能力和更高的机械强度[10]。此后，多糖手性固定相迎来井喷式的发展，并产生了许多商业化的色谱柱（如Chiralcel OD，Chiralpak AD等）。涂敷型固定相上的多糖衍生物主要依靠范德华力固定硅胶载体上，这种分子间的作用力较小，使用时容易受到流动相的影响而流失。它们通常只能使用低极性的烷烃（如正己烷、正庚烷等）和极少数醇类（如乙醇、异丙醇）作为流动相，而二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿等溶剂会使固定相溶胀或溶解，从而失去手性识别能力[3,13]。流动相的种类在很大程度上影响分离，而键合型固定相能兼容多种溶剂，增加色谱条件的选择范围。2004年，大赛璐公司成功将键合型的直链淀粉三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）固定相商业化，商品名为 Chiralpak IA。至今，已有多款商业化的键合型固定相色谱柱上市使用[14,15]。
1.1 多糖手性固定相的合成及固定化
多糖手性选择剂通常是将苯基异氰酸酯衍生物与葡萄糖单元上的2,3,6-位的羟基反应，得到苯基氨基甲酸酯取代的纤维素或直链淀粉。如果以一种异氰酸酯进行取代，最终只能得到2,3,6-位相同的三取代衍生物，反应选择性较差，很难得到双取代或不同取代基的衍生物，且没有多余的位点与硅胶键合，只能得到涂敷型的手性固定相。为了提高反应选择性，得到不同取代基，Okamoto提出区域选择性合成法[16]。此后，沈军的团队在这方面做了大量研究。作者基于Dicke[17]报道的方法，首先在直链淀粉糖单元2-位上进行选择性酯化，再用异氰酸酯取代的方法合成了含有两种不同取代基的直链淀粉衍生物[18]。后来为了得到含有三种不同取代基的多糖衍生，则在2-位酯化后选择性保护6-位羟基，再用异氰酸酯分别取代3,6-位，并将得到的衍生物通过红外（IR）、核磁共振（NMR）等技术进行结构表征和分析[18,19]。最近，Deng等 [20]利用区域选择法在壳聚糖的2,3,6-位上合成了两种不同取代基的衍生物，并研究了苯环上不同取代基对手性拆分能力的影响。
虽然多糖手性固定相展现出强大的手性识别能力，但是涂敷型固定相受到了溶剂种类的限制。因此，在过去几十年中，已经开发了多种多糖衍生物固定化的方法。1987年，Okamoto等以二异氰酸酯为交联剂将纤维素衍生物固定在3-氨丙基化的硅胶上。此后，Zou等 [21]使用多种双官能团试剂将多糖衍生物固定到硅胶上。Fréchet等[22]利用双官能团试剂将某些多糖衍生物键合在聚合颗粒上，以提高手性识别能力。然而这种方法得到的固定相的手性识别能力往往低于涂敷型，原因可能是多糖与硅胶的键合相影响了手性选择剂的空间结构，从而损失了部分手性识别位点导致的。
为了尽量避免多糖衍生物的空间结构被破坏，Okamoto的团队[23]通过磷酸化酶催化的方法，将麦芽五糖逐步聚合成具有一定长度的直链淀粉，并将淀粉末端葡萄糖残基的1-位羟基氧化成酮，再与3-氨丙基硅胶键合，最后再由大量异氰酸酯化合物取代葡萄糖的2,3,6-位。由于直链淀粉仅基端与硅胶发生键合，能很好的保留多糖衍生物的空间螺旋结构。作者认为，当直链淀粉聚合度较大且使用较长的间隔臂固定在硅胶上时，固定相的手性识别能力与涂敷型的相当。但此法制备过程步骤繁琐，且仅限于直链淀粉衍生物[23]。
Ikai等[24]开发了分子间缩聚的方法，在固定化过程中控制3-（三乙氧基硅基）丙基取代基的用量，从而选择性的控制多糖衍生物上参与键合的取代基数量。研究表明，加入约2%的3-（三乙氧基硅基）丙基时，多糖衍生物既能有效的固定在硅胶载体上，也能保持较好的键合效率，且键合的多糖手性选择剂的空间结构得以最大程度的保留，有较好的手性识别能力。
1993年，Kimata等[25]报道了一种通过乙烯基自由基固定化多糖衍生物的方法。虽然该方法糖单元上的大量双键容易发生聚合，从而影响多糖衍生物的空间结构[23]，但也为手性选择剂的固定化提出了不同思路。后来，Oliveros和Kubota的团队[26,27]对该方法进行了优化，重点是保持多糖手性选择剂在硅胶载体上键合率，增加有机物的质量占比，以保证固定相具有较高的手性识别能力。2011年，Bae等[28]利用表面引发原子转移自由基聚合技术将纤维素2,3-双（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）固定在硅胶载体表面，并通过红外、热重分析、元素分析等手段进行表征，其纤维素衍生物约占总质量的24%-25%，并在氯仿、四氢呋喃等溶剂中对10种外消旋化合物进行测试。结果显示，该固定相在硅胶表面键合牢固，且具有较高的手性识别能力。
Francotte等[29]研发出一种紫外光照射或热处理的方法使多糖衍生物固定化。该方法的优势在于，固定化的过程中不需要加入额外的取代基，步骤相对简单。此后，Francotte等 [29]将涂敷了纤维素手性选择剂的硅胶溶于甲醇-水中，在紫外光照射下成功得到了固定化的纤维素4-甲基苯基甲酸酯。作者研究认为，即使在没有自由基催化的情况下，多糖衍生物也能在紫外光作用下发生交联反应而固定在硅胶表面，固定相在提高耐溶剂性的同时，也保持了相当的手性识别能力。
在过去的20年中，有关点击化学的应用在分离科学多有报道，其中包括许多色谱材料的制备，其特点是反应条件温和（如室温，水溶液中等），反应选择性强，反应收率高等[30]。Bui等[31]利用铜（I）离子催化的“炔-叠氮”环加成反应合成了纤维素三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）固定相。Yin等人[32]将可控量的丙烯酸酯加入纤维素链中，随后，通过“硫醇-烯”点击反应将上述手性选择剂键合到硫醇改性的硅胶上，成功制备了丙烯酸纤维素3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯固定相，并通过FTIR和NMR进行表征。当丙烯酸酯的取代度仅0.012时，获得的固定相与相应的涂敷型固定相手性识别能力相似，甚至更佳[32]。
另外，寻找合适的溶剂溶解多糖有利于加快合成反应的进行。传统的二异氰酸酯合成法中使用的吡啶、甲苯等溶剂，有很强的毒性，而均相合成法中使用的1-烯丙基-3-甲基咪唑氯离子液体（AmimCl），能很好的溶解多糖分子，取代原来的吡啶、甲苯等有毒试剂，并能克服非均相工艺中产物均一性差，取代度不能控制等缺点，是多糖手性固定相制备中的重要溶剂[33]。
1.2 多糖手性固定相的表征方法
采用不同的表征方法来确定固定相制备过程中各个阶段的理化性质，对于确定制备及固定化的过程是否成功，以及了解对映体的分离行为和结果都有着重要意义。纤维素或直链淀粉等多糖被取代基取代后，其分子结构，官能团等发生变化，因此可以通过元素分析确定各个元素的占比，氮元素的增加可以有力的证明氨基甲酸酯基团取代了多糖上原有的羟基。傅里叶变换红外光谱（FTIR）和核磁共振（NMR）可以有效的反映出分子结构，红外3350cm-1附近的-OH吸收峰减弱，1700cm-1附近的羰基吸收峰以及指纹区600-900cm-1出现苯环上氢的吸收峰增强，均可证明羟基被苯基氨基甲酸酯取代；而H、C和Si的NMR谱可以有效的阐明多糖固定相的结构以及取代反应的完全程度。热重分析（TGA）则能用来确定固定相的热稳定性以及固定在硅胶载体上的有机物含量[31, 34]。
扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）可以直观的看到固定相的硅胶颗粒，对于固定相的形态、孔径、核壳颗粒评估至关重要。多糖衍生物涂敷或键合在硅胶载体后，硅胶表面会变得粗糙，且硅胶颗粒之间会发生聚集，SEM能很好的观察这些现象[35]，而有关硅胶孔径、孔结构以及核壳颗粒的内部结构等，可以从TEM的图像中获得[3]。另外，X射线衍射（XRD）也可用于深入了解硅胶的孔隙结构。
1.3 多糖手性固定相的识别机理
多糖是d-吡喃葡萄糖单元通过β-1,4糖苷键（纤维素）或α-1,4糖苷键（直链淀粉）连接形成的线性螺旋结构的聚合物。而多糖手性选择剂是将葡萄糖单元上的部分或全部羟基用苯甲酸酯或苯基氨基甲酸酯衍生化，并且大多数的取代基苯环的不同位置具有甲基、氯原子等取代。多糖的螺旋结构形成基本骨架，苯甲酸酯或苯基氨基甲酸酯取代基形成螺旋槽，极性的氨基（-NH）和羰基（-C=O）位于靠近多糖骨架的凹槽内，而疏水的苯基部分位于螺旋槽外部。极性基团可以和被测物质形成氢键，苯环与被测物之间容易形成π-π相互作用，所以多糖选择剂与手性被测物之间主要存在氢键、π-π相互作用以及范德华力[36、37]。苯基氨基甲酸酯上的苯环与氨基单键相连，具有一定的灵活性，与被测物结合时苯环可以调整方向以增强π-π相互作用和范德华力[37]。
多糖手性选择剂的苯环的取代基的种类和位置也对手性识别能力有很大影响，Okamoto的团队[10]研究表明，纤维素衍生物的苯基上含有吸电子取代基（卤素）或供电子取代基（烷基）时，选择剂的手性识别能力增强。这些取代基能改变氨基甲酸酯基团的极性，卤素能增强-NH上氢的酸性，与含有亲核基团的化合物形成氢键的能力增强。相反，甲基能增加羰基上的电子云密度，从而增加与质子供体的化合物形成氢键的能力。而较强极性的取代基，如硝基、甲氧基等，则会降低选择剂的手性识别能力，这可能是由于极性基团形成了非手性的识别位点[10]。取代基的位置不同对选择剂的手性识别能力也有影响，对位取代的手性识别能力高于大多数邻位取代的苯基氨基甲酸酯衍生物，这可能是由于邻位取代的纤维素衍生物的高级构象不规则导致的。直链淀粉衍生物的手性识别与纤维素基本相似，不同之处在于，某些邻位取代的直链淀粉衍生物也表现出较高的手性识别能力，如5-氯-2-甲基和5-氟-2甲基等。这可能与纤维素和直链淀粉的螺旋结构不同有关。Peng等[38]将含有卤素和甲基取代的多糖衍生物固定相与二甲基取代的固定相进行了对比研究，证明了其手性识别能力具有互补性。Toribio等[39]在超临界流体色谱上评估了四种不同取代的纤维素和直链淀粉衍生物，作者认为氯基团的引入提高了选择剂的手性识别能力，这与上述Okamoto等的研究结果一致。
近年来，Peluso等[40]对含有卤素的手性分析物做了大量研究，并指出卤素键在手性分离中的贡献。作者认为，卤素原子与具有亲电性的原子成键后，其电子云密度分布存在差异，电子云密度较低的区域，具有正静电势，形成所谓的σ空穴，而芳环上的卤原子能使芳环上的π电子云密度降低，形成具有正静电势的π空穴。σ空穴和π空穴可以高度定向的与孤对电子等负静电势的位点相互作用，所以卤素键与多糖手性固定相之间的静电相互作用可能驱动了异构体的分离[41、42]。作者以一系列的六卤化4,4’-联吡啶类化合物为模型，在直链淀粉与纤维素基的固定相上进行了实验，其中碘取代的化合物与多糖固定相显示出显著的相互作用能力[41]。
随着计算机技术的发展，越来越多基于多糖衍生物分子水平的手性识别机制研究被报道出来。Sechi等[43]通过分子动力学（MD）模拟出三种不同取代的直链淀粉三（苯基氨基甲酸酯）衍生物在虚拟溶剂正己烷/异丙醇（90:10）中的构象。结果表明，苯环上3,5-二甲基取代的衍生物呈杯状空腔，4-甲基取代的衍生物呈开放形空腔，而2,5-二甲基取代的衍生物则呈现阻碍形空腔，其中杯状空腔的形状和大小有利于不同形状的手性化合物的结合，这很好的解释了3,5-二甲基取代的直链淀粉衍生物具有广泛的手性识别能力。后来，作者在五种不同的3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯为取代基的多糖手性色谱柱上分离3,3’-二溴-5,5’-双二铁烯基乙炔基-4,4’-联吡啶对映异构体，并与不含二铁烯基但结构类似的化合物进行比较。结果表明，含有双二铁烯基结构的化合物与类似物相比，能更好的穿透到直链淀粉选择剂的沟槽中，且两种对映体的分离显示出不同的热力学曲线，这证明二者的手性识别机制和非共价键的相互作用不同，诱导偶极子形成的色散力可能在驱动双二铁烯基联吡啶对映体的分离上起到作用[43]。
利用分子建模等计算机手段，Peluso和Chankvetadze提出一种计算对映体和选择剂构象和静电势的分析方法，并用其阐明了2-（苄基亚磺酰基）苯甲酰胺在纤维素三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）固定相上的识别机理[44]。该对映体在固定相上具有非常特殊的选择性（α＞100），通过计算模拟得出，两种对映体不同的电子密度等值面与色谱行为的保留因子k值存在显著的关联性。在异丙醇作为流动相时，R构型的对映体先洗脱，其构象存在分子内氢键而具有较小的构象自由度，所以R型对映体不易与固定相结合，而S型对映体则没有这种构象限制，从而能够与固定相产生氢键作用而增加保留。作者还用同样的方法对其他17种多糖固定相进行了分离能力预测。
Saleh等[45]在正相模式下，通过分子对接，研究了5种β受体阻滞剂与纤维素三（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）固定相的相互作用，结果表明，氢键相互作用和π-π相互作用是手性识别的主要驱动力，通过分子动力学模拟研究了溶剂在动态条件下对手性识别的影响，其结果与色谱分离结果一致。Ianni等[46]利用分子建模与电子圆二色光谱（ECD），在没有单一对映体标准品的情况下，确定了两种四环喹啉衍生物的四个对映体洗脱顺序。分别收集不同对映体组分，并进行ECD研究和分子对接模拟，结果显示，分子对接中单个对映体的对接分数与ECD推断的洗脱顺序一致。
多糖手性固定相的手性识别机理除了固定相和对映体之间的分子相互作用之外，流动相组成也在很大程度上影响了固定相的手性识别过程。不同的流动相组成既有可能改变多糖的二级结构[47]，也可通过醇类改性剂占据手性识别位点而影响对映体分离。Li等人[48]对10种抗胆碱能药物的对映分离机理进行研究，作者认为，醇类流动相与被测物质竞争固定相上的手性识别位点，也可以通过与手性腔附近的非手性位点结合，从而影响固定相手性腔的空间环境。另外，作者认为空间位阻在手性识别中也起到重要作用，较刚性的被测物可能无法与固定相匹配，从而降低固定相对对映体的识别。最近的一项研究表明，不同浓度的异丙醇能引起Chiralpak ID、IF、IG三种固定相的构象变化，从而影响泛内酯、扁桃酸甲酯等对映体的保留行为，甚至出现流出顺序反转[49]。
Kishimoto等人[50]制备了不同侧链的直链淀粉衍生物固定相，并对14种外消旋体的色谱行为进行了研究，作者认为，直链淀粉衍生物的手性识别能力与立体构象的链刚性有关，由较大侧基形成的稳定刚性螺旋结构是手性识别的关键。作者还比较了线性、支链和环状的直链淀粉衍生物的手性识别能力，结果显示，线性＞支链＞环状，所以线性的直链淀粉构象也在分离性能中发挥重要作用。
Zhao及其同事[51]通过分子动力学模拟，比较了12个糖单元组成的直链淀粉三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）在甲醇和正庚烷/异丙醇（90:10）中的结构。结果显示，聚合物在两种溶剂中均为左旋，但在正庚烷/异丙醇中更加伸展。在正庚烷存在的条件下，异丙醇分子比甲醇分子更加靠近多糖主链，这一研究从分子水平揭示了溶剂类型对多糖衍生物结构的影响。Ma等人[52]研究了芳香性联烯化合物在纤维素三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）上的分离。作者通过振动圆二色谱（VCD）等计算确定了每种异构体的绝对构型，并研究了不含正庚烷和含正庚烷条件下固定相的结构，研究表明，正庚烷可以改变固定相分子间和分子内氢键，从而改变其构象。最新的一项研究表明[53]，利用化学合成的L型纤维素骨架取代天然纤维素的D型骨架的衍生物固定相，分离6种对映体时均出现流出顺序的反转，并且使用等量的D，L型纤维素时，对映体出现共流出现象，这证明了相反构型的固定相与对映体之间的作用强度相反，与Chankvetadze在之前得出的结论一致[54]。
Hu的研究小组[55]利用分子动力学模拟研究了吡唑衍生物在色谱柱Chiralcel OJ（纤维素三（4-甲基苯甲酸酯））上的洗脱行为。研究变量包括7种流动相和不同的柱温。结果表明，流动相对对映体分离和流出顺序均有显著影响。MD模拟表明，在含有极性溶剂（乙醇、异丙醇或水）的流动相中，S构型与固定相的相互作用能高于R构型，这与液相中观察到的洗脱顺序一致；而在真空和正己烷中，R构型与固定相的相互作用更强，洗脱顺序发生反转。所以，利用分子建模预测化合物的洗脱顺序应充分考虑流动相、选择剂的构象等因素，避免产生误导。
温度能影响分离过程中的热力学参数，通过绘制范特霍夫曲线，可以得出对映体的分离过程是焓驱动或熵驱动的。在等对映体选择性温度（Tiso）下，两个对映体的焓与熵对分离的贡献相抵消，选择因子α为1，此时对映体共流出，而在Tiso两侧，对映体的流出顺序反转。
一般情况下，Tiso远高于普通的液相色谱柱温，液相上很难观察到这种洗脱顺序的反转，但Matarashvili等人[56]在一项研究中观察到非诺洛芬和酮洛芬在涂敷型和键合型直链淀粉手性固定相上均有温度相关的洗脱顺序反转。另一项关于卡维地洛的研究表明，在正相模式中，将流动相正己烷/异丙醇/二乙胺（50：50：0.1）中异丙醇替换为乙醇时，卡维地洛在Chiralpak IG-3（直链淀粉三（3-氯-5-甲基苯基氨基甲酸酯））上的Tiso从97℃下降到29℃，证明在乙醇存在的条件下，洗脱顺序有可能反转[57]。绘制范特霍夫曲线需要做大量实验，将数据带入方程进行拟合，从而得出斜率与截距，但实验数据受很多因素的干扰，往往存在误差，所以Felinger的研究小组认为应谨慎考虑范特霍夫曲线中得出的结论[58]。作者认为手性固定相的表面存在对映结合位点和非对映结合位点，其他参数比如色谱柱的长度、粒径和流速等都会影响范特霍夫曲线，且相比不易准确得到，所以从图中得出的数据仅是估计值而非真值。
1.4 应用
高效液相色谱（HPLC）是最常用的外消旋化合物分离分析手段，近年来，仍有许多利用多糖手性固定相在HPLC上进行分离。2012年，Zhang等人[59]在6种键合型多糖手性柱（Chiralpak IA-IF）上分析了123种不同结构的手性化合物。作者首先采用了正己烷/异丙醇以及正己烷/乙醇体系，结果表明，Chiralpak IA-ID组合可以将113种化合物基线分离，而未分离的化合物仅为2个。之后，作者从123个化合物中选出57个，按结构分为11类进一步研究，尽管在单个色谱柱上不能基线分离所有的化合物，但每种固定相对特定结构化合物有着较高的手性识别能力，不同固定相之间存在互补性。这对于快速筛选色谱柱分离复杂样品有很大帮助。
Némti等人[60]研究了含有唑环的单萜内酯与单萜酰胺衍生物在涂敷和键合的多糖手性柱上的色谱行为，比较了正相模式和极性有机模式下分离的有效性，并评估了流动相添加剂在不同模式下产生的影响。结果表明，大多数情况下，涂敷型固定相的对应选择性更高，酸碱添加剂能有效影响峰的对称性，但对固定相的手性识别能力无显著改变。此外，作者还发现一个基于纤维素衍生物的手性固定相上存在滞后效应的例子，这可能与早期的研究结果不同，证明了滞后效应普遍存在于多糖基的手性固定相。
Nguyen等人[61]首次研究了紫衫前胡醇及其衍生物在多糖手性柱上的分离行为，并用分子对接模拟辅助阐明识别机理。以正己烷和三种醇类（乙醇、异丙醇、正丁醇）的混合物为流动相，在5种不同色谱柱上进行3对对映体的分离。结果表明，涂敷或键合的直链淀粉三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）固定相均具有较高的手性识别能力。从分子对接模拟的结果中得出，疏水作用和π-π相互作用是驱动分离的主要作用力，对映体与固定相的结合能为负值，同一对对映体中，结合能越大，越早流出，这与色谱实验的结果一致。但分子对接模拟的是真空条件，忽略流动相的作用，所以不同的对映体之间的流出顺序与结合能的大小不相关，还需要分子动力学模拟实验得出更完善的数据。另外，作者认为对映体的流出顺序应综合考虑各种作用力类型、数量以及强度。
Champion
Jr等人[62]研究了有机磷杀虫剂在10种键合型多糖手性柱上的分离情况，并对柱温和流动相组成进行优化。结果表明，所有的有机磷杀虫剂均能达到基线分离。Euerby等人[63]在6种多糖手性柱上研究了32种二苯尼定衍生物在极性模式下的色谱行为，其中涂敷的纤维素三（3-氯-4甲基苯基氨基甲酸酯）固定相显示出最好的手性识别能力，另外，作者认为温度是调节对映体选择性的重要参数。Kažoka等人[64]利用7种4-取代的5-甲基吡拉西坦探究不同多糖手性色谱柱的立体识别能力，该类化合物含有两个手性中心，研究表明，涂敷的直链淀粉的三（5-氯-2-甲基苯基氨基甲酸酯）固定相表现出更好的手性识别能力。
超临界流体色谱法（SFC）具有分析速度快，溶剂绿色环保，分离效率高等特点，特别适用于手性化合物的拆分。最近的一项研究中，用键合多糖的手性柱分别在HPLC和SFC上分离三种钙通道拮抗剂，结果表明，在SFC上对映体的分离度和峰型均优于HPLC，并且具有更短的分析时间[65]。Pandya小组[66]在SFC上开发了基于直链淀粉三（3-氯-5-甲基苯基氨基甲酸酯）固定相的方法，同时对阿替洛尔、美托洛尔和普萘洛尔进行分离研究，并用分子对接模拟研究识别机理。结果显示，阿替洛尔与固定相的相互作用几乎完全通过氢键产生，而其他两种化合物的分离则主要通过疏水相互作用驱动。另外，为了提高通量，缩短洗脱时间，Berger将低扩散的SFC和亚2微米粒径的多糖手性柱联合使用，成功基线分离了反式1,2-二苯基环氧乙烷对映体，洗脱时间仅7.5秒[67]。较短的分析时间和较少的流动相残留使SFC在制备化合物方面优势巨大，虽然大多数化合物还不能做到在如此短的时间内基线分离，但高通量的仪器和小粒径的色谱柱无疑是未来发展的趋势。
表面多孔硅胶和整体柱，同样可以实现快速分离。表面多孔硅胶是将硅胶涂布在无孔的实心核上，它的优势在于扩散路径短，涡流扩散小，提高了传质和分离效率，从而具有较高的柱效和较低的柱压。而整体柱主要通过溶胶-凝胶工艺或高温烧结二氧化硅颗粒制备而成，它形成的网状大孔结构允许流动相对流，具有很高的渗透性，因此可以使用更高的流速来缩短分析时间。有关表面多孔硅胶[68]和整体柱[2]的应用已有相应的综述进行总结。
2 结论
本文重点总结了近五年多糖手性固定相在合成、识别机理和应用方面的最新进展，得出以下三个方面的结论，并指出多糖手性固定相存在不足和今后可能的发展方向。
在固定相制备方面，键合型的多糖手性固定相耐受溶剂范围广，可选择性增加，是未来多糖手性固定相的发展趋势。本文总结了七种固定化方法，其中，光化学固定的方法能很好的将手性选择剂固定在硅胶载体上并保持较高的手性识别能力。利用区域选择性固定法和分子间缩聚的方法，可以控制键合基团的数量，在有效键合的同时最大限度的保持多糖的空间结构从而提高手性识别能力。化学点击法也常用于多糖手性固定相的制备，它的优势在于选择性强，反应完全，可以根据需要键合不同的取代基，这对新型多糖固定相的开发有重要意义。另外，如壳聚糖、几丁质等多糖骨架，也是今后新型手性固定相的开发方向。
识别机理方面，本文总结了近五年来的最新成果，目前认为多糖的识别机理主要包括氢键作用，π-π相互作用，疏水相互作用和范德华力等。多糖取代基上的苯基氨基甲酸酯残基被认为是手性识别能力的重要来源，而苯环的供电子或吸电子取代基能显著影响氨基甲酸酯残基上的电子云密度，使手性识别存在互补性。近年来，对于σ空穴和π空穴的研究表明，静电相互作用也可能是驱动手性分离的作用力。随着计算机技术的发展，目前很多实验室通过分子对接和分子动力学模拟进行深入且直观的研究，有助于预测分析物的洗脱顺序，更清晰的了解固定相与分析物间的相互作用。虽然目前计算机技术预测的结果不能完全准确，但随着算力增加，实验模型和参数的完善，从而实现通过软件完全预测对映体的色谱行为，并能建立有效的多糖手性固定相评价体系，为手性色谱柱的发展提供理论指导。
应用方面，多糖手性固定相已经能解决90%以上的对映体分离问题，HPLC法是最主要的分析方法，本文例举了多糖手性固定相在制药、医学、农药等领域均有应用。未来发展的可能趋向于快速化和制备方面，随着色谱柱填料技术的改进，亚2微米硅胶、表面多孔硅胶和整体化硅胶是实现快速分离的重要手段，已经有研究表明在小粒径色谱柱上能实现秒级的洗脱，这对于需要高通量的研究实验相当有意义。此外，超临界流体色谱的流动相组成与液相色谱的正相相似，尤其适合手性化合物的分析，虽然SFC很难完全取代HPLC，但由于其流动相的可挥发性和快速洗脱的能力，已在手性制备方面表现出巨大优势。
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