气相色谱法测定替格瑞洛片中硬脂酸镁的含量
曹桂红1，王兴宁2，许波1，周青1*
（1.贵州省食品药品检验所，贵阳 550004 2.贵阳海关综合技术中心，贵阳 550004）
摘要 本研究旨在建立气相色谱柱前衍生化法测定替格瑞洛片中硬脂酸镁含量的方法，为该制剂中硬脂酸镁的使用量控制提供科学依据。采用氢火焰离子化检测器（FID），进样口与检测器温度均设定为250℃；色谱柱选用DB-WAXETR毛细管柱，柱温箱程序设置为初始温度190℃，以4℃/min的速率升至温度220℃并维持25min；载气为氮气，进样量1μl，分流比10:1。实验结果显示，硬脂酸镁在0.1010～0.6062mg/ml浓度范围之内呈良好的线性关系，其回归方程为Y=4.5138X-0.0546，相关系数r=0.9996；平均加样回收率为103.8%（n=9），相对标准偏差（RSD）为3.2%。综上，本方法可有效测定替格瑞洛片中硬脂酸镁的含量，为该制剂中硬脂酸镁辅料的质量控制与监管提供支撑。
关键词：气相色谱仪；替格瑞洛片；硬脂酸镁；含量测定
Determination of Mannitol Content in Ticagrelor Tablets by GC
CAO Guihong,WANG XingNing,XV Bo,ZHOU Qing*
(Guizhou Institute for Food and Drug Inspection, Guiyang 550004, China)
Abstract：This study established a pre-column derivatization gas chromatography method for quantifying magnesium stearate in Ticagrelor Tablets, to furnish a scientific basis for excipient quality control of the preparation. A flame ionization detector (FID) was employed, with injector and detector temperatures both maintained at 250℃. A DB-WAXETR capillary column was selected, using the column temperature program: initial 190℃, ramped to 220℃ at 4℃/min and held for 25 min. Nitrogen served as carrier gas, with 1 μl injection volume and 10:1 split ratio. Results indicated good linearity of magnesium stearate in 0.1010～0.6062 mg/ml, linear regression equation Y=4.5138X-0.0546, correlation coefficient r=0.9996; average recovery was 103.8% (n=9) with RSD=3.2%. This method enables accurate determination of magnesium stearate in Ticagrelor Tablets, supporting quality control and supervision of this excipient.
Key words: GC;Ticagrelor tablets;Mannitol;Determination
替格瑞洛（Ticagrelor）是阿斯利康公司自主研发的首款可逆结合受体、直接起效的口服二磷酸腺苷（ADP）受体拮抗剂，归属于新型环戊基三唑嘧啶类（CPTP）抗血小板药物。该药物可与血小板进行可逆性结合，兼具起效迅速、血小板抑制作用强效的特点，现已成为临床抗血小板治疗的优选药物[1-4]。
2011年7月替格瑞洛片获美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市，商品名Brilinta，适用于降低急性冠状动脉综合征患者的心血管血栓事件发生率；2012年11月，该制剂正式在中国获批进口，商品名倍林达。在临床应用中，替格瑞洛片主要用于治疗冠心病所致的急性冠状动脉综合征（ACS），包含不稳定性心绞痛、非ST段抬高心肌梗死、ST段抬高心肌梗死等病症，无论是接受药物保守治疗还是经皮冠状动脉介入（PCI）治疗的患者，均可通过该药降低血栓性心血管事件的发生风险[1-8]。依托起效快、个体疗效差异小、出血风险可控等突出优势，替格瑞洛片目前已在临床领域得到广泛的推广与应用[9-10]。
硬脂酸镁是替格瑞洛片生产中常用的辅料，同时在制药、食品、化妆品等行业应用广泛。在制药领域，其可兼具润滑剂、抗黏剂、助流剂等多重作用[11-13]。作为润滑剂时硬脂酸镁能降低颗粒之间、颗粒与冲模壁之间的摩擦力，使压片过程更加顺畅，减少黏冲现象，保证片剂的外观质量；作为抗黏剂时可防止物料在压片过程中黏附于冲头和模圈表面，使片剂易于从模具中推出，保证压片过程中保持良好的分散性；作为助流剂时可改善颗粒的流动性，使颗粒能够均匀地填充到模具中，确保片剂重量差异较小，保证每片药物含量的均匀性，从而提高片剂质量；在食品领域硬脂酸镁可作为抗结剂加入粉末状食品，防止受潮结块，保持粉体松散，同时可作为润滑剂用于食品压片；在化妆品领域硬脂酸镁可作为乳化稳定剂、润滑剂加入面霜、唇膏、眼影等产品，提升配方的延展性和稳定性，减少产品在使用时的黏腻感。硬脂酸镁在合规使用时安全性高，过量可能引发过敏、腹胀、腹泻、便秘和恶心等。所以有必要对硬脂酸镁的用量进行控制。
当前，《中国药典》采用乙二胺四醋酸二钠滴定液滴定硬脂酸镁中的镁离子，再通过换算确定硬脂酸镁的含量[14]。查阅相关文献可知，硬脂酸镁在适宜的衍生化反应后可生成棕榈酸甲酯与硬脂酸甲酯，戴学东、董莉等人采用气相色谱（GC）柱前衍生化法，完成了盐酸二甲双胍及含0.5%硬脂酸镁体系中硬脂酸镁的含量测定[15]；并且柱前衍生化法在成分含量测定领域的适用性已得到诸多研究验证：冯超、张友谊、徐雪等人运用柱前衍生化反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，对盐酸二甲双胍原料中的有关物质二甲胺进行了检测[16]；杨斯超、张慧、汪俊涵等人依托柱前衍生化-气相色谱-质谱联用技术，实现了食品中丙烯酰胺的定量分析[17]；谭亮、杨洋、张琦等人借助柱前衍生化气相色谱法，测定了旱芹非淀粉多糖中的各类单糖组分含量[18]；林丽华则针对气相色谱法测定硬脂酸含量开展了系统的方法学验证工作[19]。基于现有文献研究，并结合替格瑞洛片的制剂特性，为实现对药品中硬脂酸镁用量的精准把控，本研究采用气相色谱柱前衍生化法测定替格瑞洛片中硬脂酸镁的含量，以期为该制剂的质量控制提供可靠技术手段。
1. 仪器与试药
1.1仪器：岛津GC-2014气相色谱仪；梅特勒电子天平（十万分之一）；色谱柱：DB-WAXETR 石英毛细管柱（柱长为30m，内径为0.32mm，膜厚为1.00µm）。
1.2试剂与试药：硬脂酸镁（辅料 含量：100.0%）、正庚烷（分析纯）、三氟化硼甲醇溶液（分析纯，13%-15%）、菲（分析纯、上海麦克林生化科技有限公司）、替格瑞洛片（日常检验样品）。
1.3 溶液的制备
1.3.1内标溶液的制备
精密称取菲适量，以正庚烷为溶剂进行稀释，配制成浓度为1 mg/mL的内标储备溶液。
1.3.2对照品溶液的制备
精密称取硬脂酸镁对照品两份，质量分别为0.01009 g、0.01038 g，分别置于100 mL具塞锥形瓶中。向锥形瓶内加入15 mL衍生化试剂三氟化硼甲醇溶液，于50℃条件下振摇反应15分钟，取出后冷却至室温。随后精密加入10 mL正庚烷，密塞瓶口，置于摇床上剧烈振摇10分钟，静置待溶液分层后，取上层正庚烷相作为对照品贮备液。分别精密量取上述两种对照品贮备液各5 mL，置于10 mL容量瓶中，精密加入2 mL内标溶液，以正庚烷定容至刻度，摇匀，即得对照品溶液1与对照品溶液2。
1.3.3供试品溶液的制备
取替格瑞洛片20片精密称定，研细，精密称定细粉1g，置100ml具塞锥形瓶中，再按“1.3.2对照品溶液制备”同法衍生化制备供试品溶液。
取替格瑞洛片20片，精密称定总质量，研磨至均匀细粉。精密称取细粉1 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，依照1.3.2 对照品溶液的制备项下的衍生化及处理方法，同法操作，制得供试品溶液。
1.3.4阴性对照溶液的制备
依据生产企业提供的制剂处方，制备不含硬脂酸镁的阴性模拟对照品。精密称取适量阴性对照品细粉，参照1.3.2项下的操作步骤进行衍生化与溶液处理，即得阴性对照溶液。
2.方法与结果
2.1色谱条件
采用配备火焰离子化检测器（FID）的气相色谱仪；色谱柱选用DB-WAXETR毛细管柱（柱长30 m，内径0.32 mm，膜厚1.00 μm）；进样口温度设定为250 ℃；柱温采用程序升温模式：初始温度190 ℃，以4 ℃/min的速率升温至220 ℃，并在此温度下维持25 min；检测器温度为250 ℃；载气为氮气；进样体积1 μl；分流比10:1。
2.2 衍生化条件
量取13%～15%三氟化硼甲醇溶液15 ml作为衍生化试剂，在50 ℃的温度条件下振摇反应15分钟，完成衍生化处理。
3方法学
3.1专属性试验
分别精密吸取1.3项下配制的对照品溶液、供试品溶液、空白溶剂及阴性对照溶液各1μl，按2.1项建立的色谱条件进样检测。结果表明，阴性对照溶液在硬脂酸甲酯、棕榈酸甲酯及内标物的对应保留时间均未出现干扰色谱峰；供试品溶液中棕榈酸甲酯与硬脂酸甲酯的保留时间，与对照品溶液中相应组分的保留时间基本一致（见图 1），表明所建立的方法专属性良好。
图1 专属性试验色谱图
（注：A对照品溶液；B供试品溶液；C溶剂；D阴性对照溶液；1.棕榈酸甲酯；2.硬脂酸甲酯；3.菲）
3.2线性试验
精密称取硬脂酸镁对照品0.03031 g，置于100 ml锥形瓶中，加入13%～15%三氟化硼甲醇溶液45 ml作为衍生化试剂，于50℃条件下振摇反应15分钟。取出后冷却至室温，精密加入正庚烷30 ml，密塞瓶口并剧烈振摇10分钟，静置待溶液分层后，取上层正庚烷相作为对照品贮备液。
分别精密量取上述对照品贮备液1 ml、2 ml、3 ml、5 ml、6 ml，置于10 ml容量瓶中，精密加入内标溶液2 ml，以正庚烷定容至刻度并摇匀，制得系列浓度对照品溶液。分别精密吸取各浓度溶液1 μl注入气相色谱仪，记录色谱图。以硬脂酸镁浓度C（mg/mL）为横坐标，棕榈酸甲酯与硬脂酸甲酯的峰面积之和与内标峰面积的比值Y为纵坐标，绘制标准曲线并计算回归方程，得线性回归方程为Y=4.5138X-0.0546，相关系数r=0.9996。结果表明，硬脂酸镁在0.1010～0.6062 mg/mL浓度范围内，与上述峰面积比值呈良好的线性关系，详见表1、图2。
附表1 硬脂酸镁线性关系
硬脂酸镁浓度（mg/ml） 0.1010 0.2021 0.3031 0.5052 0.6062 |
棕榈酸甲酯峰面积（mAU） 50925 104679 160139 264016 343090 |
硬脂酸甲酯峰面积（mAU） 37327 84807 117984 220376 260061 |
内标峰面积 （mAU） 213184 217039 218802 217422 223911 |
比值 0.4140 0.8731 1.2711 2.2279 2.6937 |
图2 硬脂酸镁线性关系
3.3精密度试验
精密量取浓度为0.5045 mg/mL的对照品溶液1，每次进样1 μl，连续进样6次并记录色谱图。以棕榈酸甲酯与硬脂酸甲酯的峰面积之和与内标峰面积的比值为考察指标，计算得相对标准偏差（RSD）为0.8%。结果表明，该气相色谱仪的精密度良好。
3.4 重复性试验
取同一供试品分别精密称定6份，每份1g，按照“1.3.3”项下的方法平行制备6份供试品溶液，分别精密吸取1μl供试品溶液注入气相色谱仪进行测定，并记录色谱图，按内标法计算硬脂酸镁的含量：平均含量为9.8680mg/g，RSD为1.4 %；结果表明该试验的重复性良好。
3.5 稳定性试验
取同一供试品溶液，分别在 0h、4h、8h、12h、24h 各时间点重复测定 5 次，记录色谱图，并计算棕榈酸甲酯与硬脂酸甲酯峰面积之和同内标峰面积的比值，结果显示该比值的 RSD 为 1.7%，表明供试品溶液在 24 小时内具有良好的稳定性。
3.6 准确度试验
精密称取供试品细粉9份，每份0.5 g，分别置于100 mL具塞锥形瓶中。依据80%、100%、120% 三个浓度水平设计加样方案，对应精密加入浓度为1.0090 mg/mL的硬脂酸镁对照品溶液4 mL、5 mL、6 mL，每个水平平行制备3份样品。随后分别加入三氟化硼甲醇溶液26 mL、25 mL、24 mL，参照1.3.3 供试品溶液的制备项下方法，自“于50℃振摇15分钟”开始同法操作，制得不同水平的准确度试验溶液。再精密吸取各准确度溶液1 μl注入气相色谱仪，记录色谱图并计算加样回收率。实验结果显示，该方法的平均加样回收率为103.8%，相对标准偏差（RSD）为3.2%，表明本检测方法具有良好的准确度，具体数据详见表2。
表2 加样回收率试验结果
试验序号 | 取样量 （ml） | 相当于硬脂酸镁的量（mg） | 加入量（mg） | 回收值（mg） | 回收率（%） | 平均回收率（%） | RSD （%） |
1 | 0.5129 | 5.0613 | 4.0360 | 4.3193 | 107.02 |
103.8 |
3.2 |
2 | 0.5101 | 5.0337 | 4.0360 | 4.3603 | 108.03 | ||
3 | 0.5121 | 5.0534 | 4.0360 | 4.3311 | 107.31 | ||
4 | 0.5095 | 5.0277 | 5.0450 | 4.9859 | 98.83 | ||
5 | 0.5131 | 5.0633 | 5.0450 | 5.1337 | 101.76 | ||
6 | 0.5101 | 5.0337 | 5.0450 | 5.0181 | 99.47 | ||
7 | 0.5074 | 5.0070 | 6.0540 | 6.2567 | 103.35 | ||
8 | 0.5171 | 5.1027 | 6.0540 | 6.3135 | 104.29 | ||
9 | 0.5024 | 4.9577 | 6.0540 | 6.3047 | 104.14 |
4. 样品中硬脂酸镁的含量测定
采用本法建立的方法分别测定8家生产企业的样品，每家随机抽取6批次规格为90mg的样品，共计48批次样品中硬脂酸镁的含量测定结果,见表3。
表3 硬脂酸镁含量测定结果
序号 | 生产企业 | 处方量 （mg/片） | 含量 （mg/片） | 平均值 （mg/片） | RSD （%） |
1 | A | 3.7 | 3.07、3.47、3.75、4.07、3.18、3.41 | 3.5 | 10.6 |
2 | B | 未提供 | 3.08、2.79、2.90、3.12、3.00、3.08 | 3.0 | 4.3 |
3 | C | 3.0 | 3.07、<, /span>2.88、2.92、3.01、2.98、2.89 | 3.0 | 2.5 |
4 | D | 3.0 | 3.05、3.14、3.19、3.13、3.21、3.07 | 3.1 | 2.0 |
5 | E | 未提供 | 1.53、1.58、1.58、1.43、1.61、1.73 | 1.6 | 6.2 |
6 | F | 未提供 | 3.32、2.99、2.74、2.47、2.69、2.47 | 2.8 | 11.8 |
7 | G | 3.0 | 2.83、2.50、2.90、2.75、2.86、2.87 | 2.8 | 5.4 |
8 | H | 未提供 | 3.14、3.17 、3.07、4.01、4.69、4.87 | 3.8 | 21.4 |
从结果可以看出：企业D的批间差异最小，RSD为2.0%；企业H的批间差异最大，RSD为21.4%；说明部分企业对硬脂酸镁的投料量存在不稳定性。本文建立的方法能够科学准确地测定制剂中的硬脂酸镁，使硬脂酸镁在该制剂中的使用能得到有效监管。
6.讨论
经查询文献，硬脂酸镁是硬脂酸经皂化后，加硫酸镁反应生成的含棕榈镁与硬脂酸镁的混合物，在有衍生化溶液的条件下加热反应，采用不饱和酸甲酯化使其生成棕榈酸甲酯和硬脂酸甲酯，采用气相色谱法使用菲作为内标，计算棕榈酸甲酯和硬脂酸甲酯之和，从而达到计算硬脂酸镁含量的目的。在该色谱图中各色谱峰的分离度达到要求。
本文考察了衍生化试剂，使用三氟化硼甲醇溶液得到的色谱图峰型好；分别考察了衍生化试剂不同的实验体积（10ml、15ml、20ml、25ml和30ml）、反应温度（45℃、50℃、55℃）、反应方式（超声、振摇）及反应时间（10min、15min、20min），结果发现：精密称取替格瑞洛片细粉1g，加三氟化硼甲醇溶液15ml，于50℃振摇15分钟，反应较完全。本文还考察了不同品牌的色谱柱及仪器。由试验结果可知：即使色谱条件存在轻微调整，试验结果仍保持稳定，证实该方法的耐用性符合实验要求。
综上所述：该方法的专属性好，样品的前处理衍生化反应时间较快，稳定性和重复性较好，能准确测定替格瑞洛片中硬脂酸镁的含量，可为替格瑞洛片中辅料硬脂酸镁的使用提供科学的检测和监管方法。
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