超声优化提取茶树菇中总黄酮的研究

　　

超声优化提取茶树菇中总黄酮的研究

张博雅，郭焱，秦筱秀，覃柯棋，鲁语欣，刁全平，郭华^*

(鞍山师范学院 化学与生命科学学院,辽宁 鞍山 114007)

摘 要

本文对茶树菇中总黄酮类化合物进行超声提取，采用正交实验确定最优提取工艺。在碱性条件下对提取的总黄酮显色，用芦丁作标准品，茶树菇中总黄酮含量由紫外-可见分光光度法测定。实验数据表明，芦丁在3～15 μg/mL质量浓度范围内与吸光度数值线性关系良好，回归方程为Y= 0.1145X - 0.2172, 决定系数为 0.9997,平均回收率为99.49%，相对标准偏差为1.78%。茶树菇中总黄酮超声提取最优工艺为：提取超声温度30℃、料液质量比1：15 (g/mL)、提取超声时间25 min、乙醇体积分数60%。该法简单、易操作，可用于茶树菇中总黄酮含量测定。

关键词：茶树菇；总黄酮；超声提取；芦丁；紫外-可见分光光度法

中图分类号：TQ461 文献标识码：A 文章编号：

Optimization of Extraction of Total Flavonoids from Agrocybe aegerita

Zhang Boya, Guo Yan, Qin Xiaoxiu, Jia Keqi, Lu Yuxin, Diao Quanping, Guo Hua^*

(School of Chemistry and Life Science, Anshan Normal University, Anshan 114007, Liaoning, China)

Abstract

The total flavonoids from Agrocybe aegerita was extracted by ultrasonic method, and the optimal extraction process was determined by orthogonal experiment in the paper. The extracted total flavonoids were colored under alkaline conditions, and rutin was used as reference substance. The content of total flavonoids in Agrocybe aegerita was determined by ultraviolet-visible spectrophotometry. The experimental data showed that there was a good linear relationship between rutin and absorbance in the mass concentration range of 3~15 μg/mL. The regression equation was Y= 0.1145X-0.2172, the determination coefficient was 0.9997, the average recovery rate was 99.49%, and the relative standard deviation was 1.78%. The optimum ultrasonic extraction process of total flavonoids from Agrocybe aegerita was as follows: ultrasonic extraction temperature 30℃, solid-liquid mass ratio 1:15 (g/mL), ultrasonic extraction time 25 min, and ethanol volume concentration 60%. The proposed methodology was deemed simple and stable for total flavonoids determination in Agrocybe aegerita.

Key words: Agrocybe aegerita; Flavonoids; Ultrasonic extraction; Rutin; UV Vis spectrophotometry

收稿日期:

基金项目: 鞍山师范学院大学生创新创业训练计划项目(202510169061)

作者简介: 张博雅( 2005—) ，女，山西朔州人，2023 级本科生; 通讯作者: 郭 华( 1973—) ，男，山东临沂人，教授，研究方向为天然产物有机化学。

茶树菇（Agrocybe aegerita）隶属球盖菇科田头菇属，又名茶薪菇、柱状环锈伞、柳松菇、杨树菇等，适宜于亚热带和北温带地区生长，国内主要在江西、福建等省种植^[1]。茶树菇富含氨基酸、多糖、蛋白质、多酚、有机酸、矿物质等多种营养成分，研究表明其具有抑制肿瘤、抗氧化衰老、降低血糖等多种生物活性，可被应用于保健和药用方面^[2-5]。目前，对茶树菇中黄酮类化合物的分析较少，因此，本文通过正交实验优化茶树菇中黄酮类化合物的超声提取最佳工艺，为茶树菇科学研究提供科研数据。

1 实验部分

1.1 实验材料和试剂

茶树菇：2024年购自于江西省赣州市。

芦丁为分析纯，购于中国食品药品检定研究院，乙醇、硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠为分析纯，购于天津市津东天正精细化学试剂厂，水为去离子水。

1.2 仪器和设备

Cary50紫外分光光度计：美国瓦里安公司；BJ-800A粉碎机：铂欧五金制品有限公司；N-1300S-W型旋转蒸发器：东京理化器械株式会社；DHG-9015A电热恒温干燥箱：上海始恒设备有限公司；Research Plus单道手动移液器：德国艾本德股份公司；BSA224S电子天平：德国赛多利斯公司；KQ-300ES超声波清洗器：广州锦卓仪器设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品的处理

茶树菇洗净后置于电热恒温干燥箱中50 ℃烘干，粉碎机粉碎成粉末，冷藏备用。

1.3.2 标准曲线的绘制

称取标准品芦丁3.00 mg置于10 mL容量瓶中，加人体积分数60%乙醇溶解、摇匀并定容，得芦丁标准供试品溶液，质量浓度为0.3 mg/mL。

精密吸取0.00 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL芦丁标准品分别置于10 mL容量瓶中，依次加入5% 亚硝酸钠溶液0.50 mL、10%硝酸铝溶液0.5mL、4%氢氧化钠溶液4.00mL，每次摇匀并静置6min，最后用去离子水定容，摇匀静置15 min。在510 nm最佳吸收波长处测定显色后标准品的吸光度。以0.00 mL作为空白对照，绘制标准曲线，横坐标为芦丁质量浓度 (C，μg/mL )，纵坐标为一定质量浓度所对应的吸光度(A)，得回归方程为Y= 0.1145X - 0.2172，R² = 0.9997，表明芦丁在3～15 μg/mL质量浓度范围内与吸光度数值线性关系良好^[6]。

1.3.3 茶树菇中总黄酮的提取与测定

称取1.3.1下1.0 g茶树菇样品，并按一定的料液比量取乙醇水溶液，置于锥形瓶中，依照设定的超声时间、温度进行提取。提取液过滤，水定容，即得样品溶液。按照1.3.2的方法在测定样品吸光度，并计算总黄酮含量。

1.3.4 提取单因素实验

称取1.3.1下茶树菇样品4份，每份1 g，控制不同料液比、提取温度、乙醇浓度及提取时间，测定样品吸光度，并计算样品中总黄酮含量，考察每种单因素变化对总黄酮提取的影响。

1.3.5 提取正交优化实验

根据单因素实验结果，以乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间4种因素设计3个水平正交实验，获取最佳提取条件。

1.3.6方法学考察

1.3.6.1精密度实验

精密吸取0.3 mg/mL芦丁标准品溶液，按1.3.2项下的方法，连续6次测定吸光度。

1.3.6.2稳定性实验

精密称取茶树菇粉末1.0 g，按1.3.3项下操作制备待测品溶液，2h内测定吸光度6次。

1.3.6.3重复性实验

精密称取茶树菇粉末1.0 g，按1.3.3项下操作平行制备6份待测品溶液测定吸光度。

1.3.6.4加标回收实验

取最佳工艺条件下得到的茶树菇提取液6份，每份1.0 mL，同时分别加入不同量的芦丁标准品溶液，按1.3.2项进行测定，并计算回收率。

2 结果与分析

2.1提取时间对样品中黄酮类化合物产率的影响

控制料液比1：15(g/mL)，提取温度40℃，乙醇浓度为60%，设置提取时间为15 min、20 min、25 min、30 min。用紫外分光光度计在不同的提取时间下测定吸光度，并计算提取的总黄酮产率。结果见图1，开始时随提取时间增加，总黄酮产率明显增大，在20分钟时产率最高，随后由于茶树菇中黄酮类化合物已经较充分地被提取，随时间增加，产率反而下降，可能是一部分黄酮类化合物结构被破坏^[7]。

图1 提取时间对总黄酮产率的影响

Fig. 1 Effect of extraction time on extraction yield of flavonoids

2.2料液比对茶树菇中黄酮类化合物产率的影响

控制乙醇浓度为60%，提取温度为40℃，提取时间为10 min，设置料液比为1:10 (g/mL)、1:15 (g/mL)、1:20 (g/mL)、1:25 (g/mL)。用紫外分光光度计在不同的料液比下测定吸光度，并计算总黄酮的含量。结果见图2，随着料液比的增大，样品中黄酮类化合物的产率增大，料液比为1：15 mL/g时，黄酮类化合物的产率最高，但随料液比增加反而得率降低，可能是因为溶液增加会使茶树菇中糖类其它物质溶出，从而阻碍黄酮类化合物溶解，得率减少^[7]。

图2 料液比对总黄酮产率的影响

Fig. 2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of flavonoids

2.3乙醇体积分数对茶树菇中黄酮类化合物产率的影响

控制料液比1：15 (g/mL)，提取温度40℃，提取时间为20 min，乙醇体积分数分别为40%、50%、60%、70%。用紫外分光光度计在不同的乙醇体积分数下测定吸光度，并计算总黄酮产率。结果见图3，随着乙醇体积分数的增大，样品中黄酮类化合物的产率有着先增大后减小的趋势，乙醇体积分数为60%时，总黄酮产率最高。可能是因为乙醇比例增加，非极性增强会使其它有机化合物溶解增加，得率减少^[7]。

图3 乙醇体积分数对总黄酮产率的影响

Fig. 3 Effect of ethanol concentration on extraction yield of flavonoids

2.4提取温度对茶树菇中黄酮类化合物产率的影响

控制料液比1：15 (g/mL)，乙醇浓度为60%，提取时间为20 min，设置提取温度30℃、40℃、50℃、60℃。用紫外分光光度计在不同的提取温度下测定吸光度，并计算总黄酮产率。结果见图4，随着提取温度的升高，样品中黄酮类化合物的产率增大，提取温度为40℃时，黄酮类化合物的产率最高。但由于温度过高，黄酮类中的非黄酮类化合物的成分也逐渐析出，因此温度高于40℃后，黄酮产率明显下降^[7]。

图4 提取温度对总黄酮产率的影响

Fig. 4 Effect of extraction temperature on extraction yield of flavonoids

2.5正交实验结果及分析

茶树菇中黄酮类化合物正交实验设计方案及结果见表1。

表1 正交实验设计方案及结果

Tab. 1 orthogonal experimental analysis and results

实验序号	A 提取时间 (min)	B 料液比 (mL/g)	C 提取温度 (℃ )	D乙醇浓度 （%）	黄酮产率 (%)
1	1 (15)	1 (1:10)	1 (30)	1 (50)	0.586
2	1 (15)	2 (1:15)	2 (40)	2 (60)	0.631
3	1 (15)	3 (1:20)	3 (50)	3 (70)	0.602
4	2 (20)	1 (1:10)	2 (40)	3 (70)	0.576
5	2 (20)	2 (1:15)	3 (50)	1 (50)	0.635
6	2 (20)	3 (1:20)	1 (30)	2 (60)	0.641
7	3 (25)	1 (1:10)	3 (50)	2 (60)	0.611
8	3 (25)	2 (1:15)	1 (30)	3 (70)	0.644
9	3 (25)	3 (1:20)	2 (40)	1 (50)	0.625
优水平	A3	B2	C1	D2
R	0.007	0.015	0.004	0.006
主次顺序			B>A>D>C

由表1样品中黄酮类化合物提取正交实验结果及分析得出以下结论：茶树菇中总黄酮最佳提取条件为，即提取时间A₃（25 min）、料液比B₂（1:15 (g/mL)）、提取温度C₁（30℃），乙醇浓度D₂（60%）；极差R表明提取影响因素大小为B（料液比）>A（提取时间）>D（乙醇浓度）>C（提取温度）。

2.6方法学考察实验结果

2.6.1精密度实验结果

结果显示见表2：平均吸光度值为0.450，RSD为0.33%，小于2%，表明仪器精密度好。

表2 精密度实验结果

Tab. 2 Precision test of same solution

实验序号	A	平均值	RSD (%)
1	0.449	0.450	0.33
2	0.451
3	0.450
4	0.451
5	0.452
6	0.448

2.6.2稳定性实验结果

结果显示见表3：平均吸光度值为0.741，RSD为0.28% ，表明样品在2 h内显色稳定。

表3 稳定性实验结果

Tab. 3 Stability test of same solution

实验序号	A	平均值	RSD (%)
1	0.746	0.741	0.28
2	0.743
3	0.739
4	0.741
5	0.740
6	0.739

2.6.3重复性实验

结果显示见表4：平均吸光度值为0.730，RSD为2.11%，表明该方法重复性较好。

表4 重复性实验结果

Tab. 4 Repeatability test of same solution

实验序号	A	平均值	RSD (%)
1	0.763	0.730	2.11
2	0.725
3	0.711
4	0.748
5	0.711
6	0.722

2.6.4加标回收率实验

结果显示见表5：平均加标回收率为99.49%，RSD为1.78%，表明本方法准确度较好。

表5 回收率实验结果

Tab. 5 Experimental results of sample recovery

实验序号	取样量 (mL)	对照品加入量 (mL)	测得量 (mg)	回收率 (%)	平均回收率(%)	RSD (%)
1	1.0	0.2	0.6112	102.0	99.49	1.78
2	1.0	0.4	0.6338	98.64
3	1.0	0.6	0.7255	97.52
4	1.0	0.8	0.7900	98.06
5	1.0	1.0	1.245	99.54
6	1.0	1.2	1.562	101.2

2.7最佳提取条件的验证

在上述实验测得最佳提取条件下，即乙醇浓度60%、提取温度30℃、料液比1:15 (g/mL)、提取时间25 min为实验条件重复测定6次，产率平均值为0.650%，RSD为0.49%。

3结论

本实验对茶树菇中总黄酮类化合物进行正交实验设计超声波提取，以芦丁为对照品，碱性环境显色后，于510 nm波长处利用紫外-可见分光光度法测得其总黄酮的含量为0.650%。对提取温度、料液比、提取时间和乙醇浓度进行单因素和正交实验，确定总黄酮最佳提取工艺为：提取超声时间25 min、料液质量比1:15 (g/mL)、提取超声温度30℃、乙醇体积分数60%。通过方法学考察得知实验精密度良好，样品溶液在2 h内显色稳定，可以重复进行测量操作，本实验所采用的方法可以用于测定茶树菇中总黄酮的含量。

参考文献

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