特征图谱结合化学模式识别对不同产地茯苓的成分差异研究

　　

特征图谱结合化学模式识别对不同产地茯苓的成分差异研究

陈慧芳¹ 刘倩² 李珂³ 张守平⁴

（1.中国海洋大学 医药学院，山东 青岛266000；2.中国海洋大学 医药学院，山东 青岛2660002；3.斯坦德检测集团股份有限公司 ，山东 青岛266000；4.斯坦德检测集团股份有限公司 ，山东 青岛266000）

摘要：目的 采用HPLC建立不同产地茯苓药材的特征图谱，再利用化学模式识别分析不同产地茯苓成分差异。方法 利用HPLC建立茯苓特征图谱，结合聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘法判别分析等多种化学模式识别方法评价不同产地茯苓成分差异。结果 从茯苓特征图谱中识别出8个共有峰,各批次的相似度在0.978～1.000;基于对照品比对法指认出5个色谱峰;聚类分析和主成分分析的结果显示,15批3个产地茯苓药材共分为2类，四川广元旺苍和安徽安庆岳西为一类，贵州铜仁江口为另一类，OPLS-DA确证了峰7(茯苓酸)、峰6(去氢茯苓酸)是不同产地茯苓差异性的关键性成分。结论 此研究构建的不同产地茯苓HPLC特征图谱的分析方法具备良好稳定性与可靠性，能够为茯苓的产地溯源以及品质评估提供有力的科学支撑与参考依据。

关键词：茯苓；特征图谱；不同产地；化学模式识别

作者简介：陈慧芳（1999-12），女，汉族，河南，中国海洋大学，硕士研究生，研究方向为中药分析。

Research on the component differences of Poria cocos from different origins using characteristic mapping and chemical pattern recognition.

CHEN Huifang¹ Liu Qian² Li Ke ³ Zhang Shouping⁴

(1. Ocean University of China, School of Medicine, Shandong，Qingdao, 266000; 2. Ocean University of China, School of Medicine, Shandong，Qingdao, 2660002; 3. Standard Testing Group Co., Ltd., Qingdao, Shandong 266000; 4. Standard Testing Group Co., Ltd., Qingdao, Shandong 266000)

Abstract: Objective: To establish characteristic HPLC chromatograms of Poria from different origins and to study the compositional differences of Poria from different origins using chemometrics. Methods: HPLC was used to establish the characteristic chromatograms of Poria, combined with various chemometric methods such as cluster analysis , principal component analysis ,orthogonal projections to latent structures discriminant analysis to evaluate the compositional differences of Poria from different origins. Results: Eight common peaks were identified from the characteristic chromatograms of Poria, with similarity among batches ranging from 0.978 to 1.000; five chromatographic peaks were identified based on reference standard comparison.The results of cluster analysis and principal component analysis show that the 15 batches of Poria can be divided into two categories: one category includes Sichuan and Anhui, and the other is Guizhou.

The results of CA and PCA showed that 15 batches of Poria from three origins were grouped into two categories: one category included Wangcang, Guangyuan, Sichuan and Yuexi, Anqing, Anhui, while the other included Jiangkou, Tongren, Guizhou. OPLS-DA confirmed that Peak 7 (Pachymic acid) and Peak 6 (Dehydropachymic acid) were key components responsible for the differences in Poria from different origins. Conclusion: The analytical method established in this study for the HPLC characteristic chromatograms of Poria from different origins demonstrates good stability and reliability, providing strong scientific support and reference for tracing the origin and assessing the quality of Poria.

Keywords: Poria cocos; characteristic spectrum; different origins; chemical pattern recognition.

引言

茯苓作为传统道地药材，其化学成分复杂多样，包含三萜类、多糖、脂肪酸及甾醇等活性物质，其中三萜成分在免疫调节、抗肿瘤等药理作用中发挥关键作用[1-2]。然而，受产地环境（如气候、土壤等）的显著影响，不同产区茯苓的化学成分组成及含量存在客观差异，这种差异可能直接导致药材品质与疗效的波动[3-6]。

当前，茯苓研究多聚焦于化学成分分离鉴定及药理机制探索，而针对不同产地茯苓的特征图谱的特征分析，尤其是结合化学模式识别分析不同产地的成分差异的研究较少[7-11]。因此，本文利用HPLC建立茯苓特征图谱，结合化学计量学分析不同产地茯苓差异性的关键成分，为后期茯苓的溯源及品质评估呈递参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

赛多利斯Quintix125D-1CN十万分之一天平(德国赛多利斯集团);750-DE超声清洗仪（舒美）;赛默飞U3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技公司);Thermo Accalim120色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)(Thermo公司)；HH-4水浴锅（金坛白塔斯宝仪仪器）。

1.2 试药

对照品猪苓酸C（N18IB232632，纯度98.8%）、去氢土莫酸（A28IB214159，纯度98.5%）、去氢茯苓酸（J08IB211850，纯度98.1%）、茯苓酸(N14IB232196,纯度99.6%)、松苓新酸（D24J10S80630，纯度99.8%）均购自上海源叶生物科技有限公司。甲醇、乙腈、乙醇为色谱纯（上海安谱实验科技股份有限公司）,磷酸为分析纯(西陇科学),实验室自制水为超纯水。

1.3 药材

15批茯苓药材于四川广元旺苍、安徽安庆岳西、贵州铜仁碧江产地收集，经斯坦德检测集团股份有限公司技术工程师张守平鉴定为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.) Wolf菌核的干燥菌核，见表1。

表1茯苓样品信息表

Tab.1 Poria Sample Information Sheet

编号	名称	产地	批号	生长年限
S1	茯苓	四川广元旺苍	20241018	5-12个月
S2	茯苓	四川广元旺苍	20241005	5-12个月
S3	茯苓	四川广元旺苍	20241108	5-12个月
S4	茯苓	四川广元旺苍	20240830	5-12个月
S5	茯苓	四川广元旺苍	20241026	5-12个月
S6	茯苓	四川广元旺苍	20240825	5-12个月
S7	茯苓	安徽安庆岳西	20241022	5-12个月
S8	茯苓	安徽安庆岳西	20241105	5-12个月
S9	茯苓	安徽安庆岳西	20240830	5-12个月
S10	茯苓	安徽安庆岳西	20241023	5-12个月
S11	茯苓	贵州铜仁碧江	20240822	5-12个月
S12	茯苓	贵州铜仁碧江	20241028	5-12个月
S13	茯苓	贵州铜仁碧江	20241108	5-12个月
S14	茯苓	贵州铜仁碧江	20241112	5-12个月
S15	茯苓	贵州铜仁碧江	20241116	5-12个月

2 方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为Thermo Accalim120；检测波长210nm；柱温为30℃；进样体积为10 uL；流速为1.0 mL/min；流动相为乙腈（A)-0.05%磷酸水(B);洗脱程序为0～35min，19%A；35～55min，19%～29%A；55～70min，29%A；70～85min，29%～19%A。

2.2溶液配制

2.2.1混合对照品溶液的制备

精密称取猪苓酸C、去氢土莫酸、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸对照品适量，加70%甲醇制成浓度分别为70.27、105.076、150.92、180 、149.24μg · ml^-1的混合对照品溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备

以70%甲醇为溶剂，取2 g本品粉末，加入20 mL溶剂，水浴锅70℃回流1.5 h，摇匀，过滤，即得。

2.3方法学考察

2.3.1 精密度试验

取茯苓（S1）供试品溶液，按2.1项色谱条件连续进样6次。以6号峰去氢茯苓酸为参照峰（色谱峰分离度好且峰面积较大）。测得各共有峰相对保留时间RSD＜1.74%，相对峰面积RSD＜1.93%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

取茯苓(S1)供试品溶液，按2.1项色谱条件，分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，以6号峰去氢茯苓酸为参照峰，测得各共有峰相对保留时间RSD<0.13%,相对峰面积RSD<3.0%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验

取茯苓(S1)供试品，按2.2.2项方法平行制备6份，进样测定，以6号峰去氢茯苓酸为参照峰，测得各共有峰相对保留时间RSD<0.41%,相对峰面积RSD<2.89%,表明该方法重复性良好。

图1 15批茯苓共有模式HPLC叠加色谱图

Fig.1 Overlay chromatogram of HPLC for 15 batches of Poria cocos

注：1-猪苓酸C，2-去氢土莫酸，6-去氢茯苓酸，7-茯苓酸，8-松苓新酸

2.4 HPLC特征图谱的建立及相似度评价

精密称取 15 批茯苓，依 2.2.2 项制供试品溶液，按 2.1 项色谱条件进样。把图谱文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 A 版），以 S11 作参照图谱，时间窗宽度设 0.1，用中位数法生成对照图谱，经多点校正Mark 峰匹配后计算相似度。S1～S6 的相似度在 0.978 至 0.984 之间，这些样品为四川广元旺苍产地的茯苓；S7～S10 的相似度在 0.981 至 0.985 之间，属于安徽安庆岳西产地的茯苓；S11～S15 的相似度均高于 0.990，为贵州铜仁碧江产地的茯苓。这表明不同产地茯苓药材所含成分存在一定差异[12]。在图谱中共标定8 个共有峰（图 1）,对照品比对法指认出 5 个色谱峰，分别是猪苓酸C（1 号峰）、去氢土莫酸（2 号峰）、去氢茯苓酸（6 号峰）、茯苓酸（7 号峰）、松苓新酸（8 号峰）。

2.5化学模式识别分析

2.5.1聚类分析（CA）

将15批茯苓特征图谱中5个共有峰峰面积导入到SPSS 26.0进行系统聚类分析。采用组间连接法与平方欧氏距离算法生成谱系图，当距离阈值为10时，茯苓被分为两类，S1～S10（四川广元旺苍、安徽安庆岳西）为第一类，S11～S15（贵州铜仁碧江）为第二类。该结果与相似度评价一致，表明产地差异影响茯苓质量。见图2。

图2 15批茯苓药材的聚类分析图

Fig.2 Cluster analysis chart of 15 batches of Poria medicinal materials

2.5.2 主成分分析(PCA)

将15批茯苓5个共有峰峰面积数据导入SPSS 26.0与SIMCA 14.1软件进行主成分分析。表3可知，前两主成分初始特征值分别为2.866、1.846，累计方差贡献率为82.246%，大于80%[13]，说明二者能有效提取特征图谱关键信息。PCA得分图显示，15批次样品分为两类：S1～S10（四川广元旺苍、安徽安庆岳西）为第一类，S11～S15（贵州铜仁碧江）为第二类。该分类结果与相似度分析、聚类分析结果一致（图3）。

图3 15批茯苓药材的PCA得分图

Fig.3 PCA score plot of 15 batches of Poria cocos medicinal materials

表2 主成分分析特征值及方差贡献率

Tab.2 Principal Component Analysis Eigenvalues and Variance Contribution Rate

成分	初始特征值			提取载荷平方和
	特征值	方差百分比	累计方差贡献率 %	特征值	方差百分比	累计方差贡献率 %
1	2.866	57.323	57.323	2.866	57.323	57.323
2	1.246	24.924	82.246	1.246	24.924	82.246
3	0.714	14.29	96.536
4	0.128	2.554	99.09
5	0.045	0.91	100

图4 15批茯苓药材的OPLS-DA得分图

Fig.4 OPLS-DA score plot of 15 batches of Poria cocos herbal materials

2.5.3 正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)

OPLS-DA是有监督的模式识别方法，能过滤无关变量，维持模型预测性能时简化结构，凸显组间差异[14]。将茯苓5个共有峰峰面积导入SIMCA 14.1，构建OPLS-DA监督模型对不同产地茯苓分类。得分图表明，15批次茯苓明显分为四川广元旺苍与安徽安庆岳西（S1～S10）、贵州铜仁碧江（S11～S15）两类，分类效果优于PCA（图4）。模型验证指标显示，R²X=0.986，Q²=0.934，表明该模型具有优异的拟合优度和预测能力[15-16]。进一步分析各共有峰的投影变量权重值（VIP）发现（图5），VIP值与变量对组间差异的贡献度呈正相关，通常以VIP>1作为差异代谢物筛选阈值[17]。最终筛选出2个VIP值显著（VIP>1）的差异成分，分别是峰7（茯苓酸）和峰6（去氢茯苓酸），它们可作为产地质量评价的标志性成分。

图5 15批茯苓药材中5个化学成分的VIP

Fig.5 VIP of 5 chemical components in 15 batches of Poria herbal materials

3讨论

3.1特征图谱方法学建立

茯苓作为传统中药材，具有悠久的药用历史和显著的医疗功效，其药效的发挥主要依赖于所含的多糖类和三萜类化学成分。目前，在茯苓化学成分提取的相关研究中，乙醇和甲醇是较为常用的提取溶剂[18 - 19]。为了筛选出最适合提取茯苓中多糖类和三萜类化学成分的溶剂，首先开展了溶剂种类筛选实验。分别选取乙醇和甲醇作为提取溶剂。对比发现，甲醇作为溶剂时，色谱图中的峰分离情况更为理想。各个峰之间的间隔适中，峰形尖锐且对称，能够清晰地分辨出不同的化学成分，因此最终确定甲醇为提取溶剂。在确定甲醇为溶剂的基础上，为进一步优化提取条件，提高提取效率，进一步考察了不同浓度甲醇溶液的提取效果。分别选取甲醇、50%甲醇和70%甲醇三种不同浓度的溶剂进行实验。实验过程中，采用超声提取方式，以指标性成分的含量为依据，最终确定为70%甲醇。除了溶剂种类和浓度外，提取方式也是影响提取效果的重要因素。于是进一步分别考察超声提取方式与回流提取方式，以分离度为依据，回流提取方式效果更佳，因此最终确定为回流提取。通过上述一系列系统的实验研究和优化筛选，最终确定了以 70%甲醇为溶剂，采用回流提取方式来提取茯苓中的多糖类和三萜类化学成分。

3.2化学模式识别

本研究采集了来自 15 个不同产地的茯苓药材样品，构建高效液相色谱（HPLC）特征图谱，检出了 8 个共有峰。为确保成分鉴定的准确性，我们借助对照品进行比对指认，最终明确其中 5 个共有峰所对应的化学成分，分别是猪苓酸 C（1 号峰）、去氢土莫酸（2 号峰）、去氢茯苓酸（6 号峰）、茯苓酸（7 号峰）以及松苓新酸（8 号峰）。这些化学成分的确定，为我们后续深入分析茯苓药材的质量特征提供了关键依据。

运用聚类分析和主成分分析（PCA）两种多元统计方法。在聚类分析过程中，选定平方欧氏距离 10 作为分类阈值。经过系统的计算与分析，15 批茯苓样品被清晰地划分为两类：第一类涵盖 S1～S10 号样品，其产地为四川和安徽；第二类为 S11～S15 号样品，产地是贵州。值得一提的是，这一聚类结果与相似度评价结果高度一致，有力地表明不同产地的茯苓药材在质量上确实存在显著差异。

主成分分析（PCA）作为一种无监督的分析方法，在本研究中同样发挥了重要作用。它通过对样本之间相似性的深入分析，实现了对不同产地茯苓药材的有效区分，相关结果直观地展示在图 3 中。这一结果进一步验证了产地因素对茯苓药材质量的重要影响[20-21]。

为了更精准地找出导致不同产地茯苓药材质量差异的关键成分，进一步采用了正交偏最小二乘判别分析（OPLS - DA）。该方法通过对各共有峰的投影变量权重值（VIP）进行深入分析。研究发现，峰 7（茯苓酸）和峰 6（去氢茯苓酸）的 VIP 值均大于 1。在 OPLS - DA 分析中，VIP 值是衡量变量对分类结果重要程度的关键指标，VIP 值大于 1 通常意味着该变量对样本的分类具有重要贡献。因此，这一结果清晰地表明，茯苓酸和去氢茯苓酸这两种化学成分是导致不同产地茯苓药材质量差异的主要因素。基于这一发现，可以将茯苓酸和去氢茯苓酸作为茯苓药材的差异标志物。

3.3小结

进一步从化学结构及代谢特征与产地环境的深度适配性来分析茯苓酸与去氢茯苓酸之所以成为区分不同产地茯苓药材的核心差异成分的原因，从结构看，茯苓酸含羧基的稳定三萜结构使其在中性土壤中通过合成酶活性优势大量积累，而去氢茯苓酸因C-25位脱氢形成的双键共轭体系在低温环境下通过CYP450酶催化实现高效转化[22-26]；代谢特征方面，去氢茯苓酸因脂溶性增强导致吸收速度较慢，但分布体积相近，其双键结构在低氧环境中更稳定，而茯苓酸羧基易受土壤金属离子影响，导致不同产地稳定性差异[27-29]。本研究最终在统计模型中，二者VIP值分别达1.60和1.22（均＞1），因此仅用此二成分建模的产地判别准确率远超去氢土莫酸、茯苓新酸、猪苓酸C等其他三萜成分（VIP＜1），充分证明其作为产地标志物的科学性与稳定性。

本研究通过成功构建 15 批不同产地茯苓药材的 HPLC 特征图谱并结合化学模式识别开展系统质量评价，精准找出峰 7（茯苓酸）和峰 6（去氢茯苓酸）为导致产地质量差异的关键成分，这不仅为茯苓质量控制提供了切实可行的技术方法与详实可靠的基础数据，有助于规范茯苓生产过程中的质量标准，保障市场上茯苓药材的质量稳定性，还为茯苓产地溯源及品质评估建立了科学依据，能有效鉴别茯苓产地，区分不同产地茯苓的品质优劣，对促进茯苓产业的标准化、规范化发展，保障消费者权益以及推动中医药事业的健康可持续发展都具有深远影响。

参考文献

[1] 王嘉蕊,张甜,蓝鑫,等.茯苓化学成分、药理活性、药食同源应用研究进展[J/OL].中成药,1-6[2025-09-14]

[2] 毛跟年，张诗韵，付超，等.茯苓皮总三萜的降血脂活性研究[J].陕西科技大学学报(自然科学版),2015,33(3):130MAO GN,ZHANG SY,FU C,et al.The hypolipidemic study of total triterpenic compounds from sclerotia of Poria Cocos[J].J Shaanxi Norm Univ(Nat Sci Ed),2015,33(3):130

[3]李鹏辉,龙慧玲,蔡媛,等.特征图谱结合化学模式识别筛选不同产地茯苓药材差异质量标志物[J].中国新药杂志,2023,32(21):2184-2190.

[4]郭芬，马巾媛，李维峰，等.普洱市栽培茯苓与茯苓皮中茯苓酸的含量测定[J].生物技术世界，2014(11):4GUO F,MA JY,LI WF,et al.Determination of porinic acid in cultivated Poria cocos and Poriae Cutis in Pu’er City[J].Biotech World,2014(11):4

[5] 崔仙红，张鹏，朱笛，等.不同产地茯苓及茯苓皮中总三萜含量比较[J].河南中医，2020,40(12):1926CUI XH,ZHANG P,ZHU D,et al.Comparison of total triterpenoids content in fuling and fulingpi from different habitats[J].Henan Tradit Chin Med,2020,40(12):1926

[6]孙雪,章登停,王慧,等.基于高光谱成像技术的茯苓产地识别[J].中国中药杂志,2023,48(16):4337-4346.

[7]沈思.茯苓皮中三萜的提取、分离纯化及其活性研究[D].武汉：华中农业大学，2008SHEN S.Extraction,Separation,Identification and Permentry Studies on Whitening Skin Activity of Triterpenes from Surface Layer of Poria cocos[D].Wuhan:Huazhong Agricultural University,2008

[8] 徐易娴,杨华,管桂萍,等.羧甲基茯苓多糖的分离纯化、结构表征及其抗氧化作用[J].湖南农业科学,2025,(01):64-70.

[9]殷梦舟.茯苓皮三萜的高效提取、分离和纯化及其抗炎活性研究[D].华中农业大学,2020.

[10]何鹏飞,高敏,文继红,等.茯苓药理作用研究进展[J].云南中医中药杂志,2024,45(08):83-87.

[11]叶青,刘东升,王兰霞,等.茯苓化学成分、药理作用及质量控制研究进展[J].中医药信息,2023,40(02):75-79.

[12] 邵远洋，彭莲，俞越童，等.基于高效液相色谱法指纹图谱技术的不同产地、不同生长方式喜马拉雅紫茉莉品质分析[J].世界科学技术-中医药现代化，2019,21(8):1709.

[13] 刘文，王钰乐，卿勇军，等.葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎谱效关系研究[J].中华中医药杂志，2018,33(9):4093.

[14] LI S S,LI K K,XU F,et al.A strategy for simultaneous isolation of less polar ginsenosides,including a pair of new20-methoxyl isomers,from flower buds of Panax ginseng[J].Molecules,2017,22(3):442.

[15] 汪杰，刘宇洁，张静，等.基于化学计量法和指纹图谱对生姜不同处理方法的成分差异研究[J].中草药，2024,55(9):3107.

[16]杨若玑,王艺霏,徐进,等.基于HPLC指纹图谱、化学计量学和含量测定评价芫荽子质量[J/OL].中成药,1-8[2025-09-12].

[17] 李真.不同基原淫羊藿化学成分差异及谱效关系研究[D].吉林大学硕士学位论文，2023.

[18]张传津,牛华星,张志民,等.茯苓多糖散中茯苓三萜的含量测定方法探究[J].饲料工业,2024,45(22):100-104.

[19]徐凡,袁杰,蒲婧哲,等.基于波长转换RP-HPLC法的茯苓皮多成分含量测定及特征图谱方法研究[J].药物分析杂志,2024,44(02):214-223.

[20] 李士敏，李强，孙崇鲁，等.基于多模式识别结合指纹图谱的三叶青产地鉴别比较研究[J].中草药，2020,51(1):197.

[21]李蕊,徐荣荣,张楚涵,等.基于UPLC指纹图谱及多成分含量测定评价不同产地黄芩质量的研究[J].时珍国医国药,2025,36(12):2278-2284.

[22]巫晓霞.茯苓化学成分与健脾利水疗效的相关性研究及其质量控制[D].成都医学院,2023.

[23]孙明月.UPLC-Q-TOF定性定量检测云南省茯苓主要三萜酸类化合物方法建立及云南茯苓三萜酸类化合物含量分析[D].大理大学,2024.

[24]刘和平.茯苓酸生物合成途径中CYP450基因的克隆与功能验证[D].华中农业大学,2022.

[25]余能富,邓涛,华小菊,等.松蔸栽培茯苓对土壤化学性质和酶化学计量比的影响[J].南方林业科学,2023,51(02):29-33.

[26]徐雷,胡引娣,刘常丽,等.茯苓不同栽培模式的土壤生态环境变化研究[J].特产研究,2022,44(04):34-38.

[27]阿拉腾其木格,蒙药材茯苓的三萜类成分及其代谢特征研究.内蒙古自治区,内蒙古自治区国际蒙医医院,2014-09-10.

[28]钟月彤,刘淑琼,黄兴琳,等.基于代谢组学的茯苓皮、茯苓、茯神药效机制研究进展[J/OL].云南民族大学学报(自然科学版),1-18[2025-09-30].

[29]禹红,刘星,张凡雄,等.茯苓多糖调控AMPK信号通路干预脂质代谢改善非酒精性脂肪性肝病的机制研究[J].中西医结合肝病杂志,2025,35(04):438-443.

订阅方式：
①在线订阅（推荐）：www.sdchem.net.cn
②邮局订阅：邮发代号24-109

投稿方式：
①在线投稿（推荐）：www.sdchem.net.cn
　　作者只需要简单注册获得用户名和密码后，就可随时进行投稿、查稿，全程跟踪稿件的发表过程，使您的论文发表更加方便、快捷、透明、高效。
②邮箱投稿：sdhgtg@163.com sdhg@sdchem.net
　　若“在线投稿”不成功，可使用邮箱投稿，投稿邮件主题：第一作者名字/稿件题目。
投稿时请注意以下事项：
　　①文前应有中英文“题目”、“作者姓名”、“单位”、“邮编”、“摘要”、“关键词”；
　　②作者简介包括：姓名、出生年、性别、民族、籍贯或出生地、工作单位、职务或职称、学位、研究方向；
　　③论文末应附“参考文献”，执行国标GB/T7714-2005标准，“参考文献”序号应与论文中出现的顺序相符；
　　④注明作者的联系方式，包括电话、E-mail、详细的通讯地址、邮编，以便联系并邮寄杂志。
　　 　                                                                                   山东化工稿件修改细则