丹参酮氨基酸酯衍生物的合成及神经保护作用初步研究-2

　　

丹参酮氨基酸酯衍生物的合成及神经保护作用的初步研究

王冬冬^#*，任常霞^#，郁译博，梁景瑞，刘懿萱

枣庄学院 食品科学与制药工程学院，山东 枣庄 277160

摘要：以丹参酮I，丹参酮IIA为原料，通过曼尼希反应将L-氨基酸酯接枝到丹参酮D环C-15位获得8种丹参酮氨基酸衍生物，其结构经过核磁共振氢谱、碳谱和质谱确证，并测试了化合物对PC12细胞的毒性及其诱导细胞分化的能力。初步测试结果表明，丹参酮I衍生物（1a-1d）的细胞毒性明显增强，且高于丹参酮IIA衍生物（2a-2d）,大部分衍生物都具有诱导PC12细胞分化的能力，其中2b、2c、2d表现出较强的诱导能力，能更好发挥神经保护作用，具有进一步研究的必要。

关键词：丹参酮；氨基酸；神经保护；PC12细胞；细胞分化

中图分类号：TQ461

Preliminary Study on the Synthesis of Tanshinone Amino Acid E Derivatives and Their Neuroprotective Effects

Wang Dongdong^#*，Ren Changxia^#, Yu Yibo, Liang Jingrui, Liu Yixuan

College of Food Science and Pharmaceutical Engineering, Zaozhuang University, Zaozhuang 277160, Shandong, China

Abstract: Eight tanshinone amino acid derivatives were synthesized by Mannich reaction using tanshinone I and tanshinone IIA as raw materials. The structures of the derivatives were confirmed by ¹H NMR, ¹³C NMR and MS, the cytotoxicity on PC12 cells and their ability to induce differentiation were tested. The preliminary test results showed that the cytotoxicity of tanshinone I derivatives (1a-1d) was stronger than that of tanshinone IIA derivatives (2a-2d), and most compounds possessed the ability to induce PC12 cell differentiation. Among them, 2b, 2c and 2d exhibited stronger induction ability and neuroprotective effect, which are necessary for further study.

Keywords: Tanshinone; Amino acid; Neuroprotection; PC12 cells; Cell differentiation

引言

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种常见的神经退行性疾病，目前，全世界AD患者已经超过五千万人，预计到2050年将达到一亿三千万。我国60岁以患病人口约为950万，随着人口老龄化进程的加速，我国的AD患者数量将逐年增长^1,2。AD的发生是复杂的多因素细胞代谢紊乱所共同导致的结果，不受一种主要的生物学因素控制，并且可能融合了多种病理生物学机制³。研究发现，AD模型细胞中氨基酸代谢紊乱，谷氨酸、色氨酸含量升高，缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等含量下降⁴，大脑海马区域特定神经元细胞的死亡与氨基酸含量、氨基酸代谢的酶活性相关^5,6。目前，还未能完全阐明AD的细胞及分子机制，因此，对相关细胞模型的研究或许能为治疗AD药物的研发提供潜在的预测模型。因此，许多具有神经元特征的细胞被广泛用于模拟AD的病理过程，例如PC12、SH-SY5Y 和 N2a 细胞，尤其PC12细胞应用最为广泛⁷。PC12细胞是一种来自大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的细胞系，属于单克隆细胞系，该细胞系是由Greene 和 Tischler于 1976 年从大鼠肾上腺髓母细胞瘤中移植而来，它与神经母细胞胚胎起源相同，被认为是未成熟神经元，这使得PC12细胞作为神经元分化和神经分泌的细胞模型，常用作神经系统研究⁸。 PC12 细胞在神经生长因子（（nerve growth factor, NGF）的诱导下会分化为类似交感神经的细胞，这些细胞在形态、生理和生化功能方面与神经元非常相似，例如会生长出细胞突起、形成类似突触的结构，并具有电兴奋性特征。此外，在 NGF 的作用下，它们能够合成乙酰胆碱并形成神经突结构。诱导神经元细胞分化有助于缓解神经退行性疾病对中枢神经系统造成的伤害⁹。

丹参为中药植物丹参干燥的根，在我国有悠久的应用历史，传统上主要用来治疗妇科疾病，对心脑血管疾病也有良好效果。现代研究发现丹参中含有40多种脂溶性化合物，其中含量较高、研究较多的是丹参酮 I （Tan-I），丹参酮 IIA（Tan-IIA），二氢丹参酮及隐丹参酮（图1）¹⁰。丹参酮水溶性差（＜10^-4mg/mL）、细胞摄取率低、透膜能力不强等因素限制其开发应用¹¹。丹参酮是中药丹参中主要的脂溶性成分和主要活性物质，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌以及神经保护作用，Tan-IIA能抵抗Aβ对神经细胞的损伤¹²，提高神经细胞存活率，降低AD诱导的海马区域NO、ROS及过氧亚硝基的释放，调控细胞自噬水平，保护海马区神经元细胞^10,13,14，在治疗AD的药物研发中，丹参酮表现出巨大的潜力。

在前期针对丹参酮的结构改造和活性研究的基础上，选用结构不同的氨基酸酯，以氨基为反应位点，通过Mannich反应对Tan-I、Tan-IIA D环的α位进行结构修饰，获得相应的丹参酮氨基酸酯衍生物，并初步测定衍生物对PC12细胞的诱导分化能力，为开发更多类型的以丹参酮为基础的治疗AD的药物提供参考。

图1 主要丹参酮类化合物的结构。

Figure1 Chemical structures of major tanshinones.

1 实验材料与方法

1.1材料

Tan-I、Tan-IIA、L-氨基酸酯盐酸盐（分析纯）购于上海阿拉丁试剂有限公司； NGF购买于未名生物医药有限公司，DMEM高糖培养基，胎牛血清（fetal bovine serum, FBS），马血清（horse serum, HS）购于美国Gibco公司，胰酶、青链霉素双抗、噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT) 、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO) 购于北京索莱宝公司。大鼠嗜铬细胞瘤PC12神经元细胞来自于中国科学院上海药物研究所。

1.2合成路线

本文共报到了8种丹参酮氨基酸酯衍生物，其合成步骤如图2所示。

1.2.1 Tan-I衍生物1a-1d的合成

在 50 mL 圆底烧瓶内加入 15 mL 冰乙酸，然后依次向其中加入 0.3 mM Tan-I， 0.6 mM L-氨基酸酯类化合物和 0.5 mL 甲醛（36%） 溶液， 避光条件下 65℃ 加热回流 10 h。反应体系冷却至室温后，转移至 1 L 烧杯内，搅拌条件下向其中缓慢加入饱和碳酸钠溶液，直至体系中无气泡产生。反应液分别用二氯甲烷和乙酸乙酯依次萃取直至水相呈无色。萃取后获得的二氯甲烷相和乙酸乙酯相分别用蒸馏水洗三遍，然后减压蒸馏除去有机相获得固体化合物，固体经硅胶柱层析分离纯化获得目标产物，洗脱体系为石油醚-乙酸乙酯（10:1~10:5）。四种化合物性状和结构表征如下：

图2 丹参酮氨基酸酯衍生物的合成路线及目标产物的结构。

Figure2 Synthesis route of tanshinone amino acid ester derivatives，and structures of the targeted compound.

15-N-（2-氨基乙酸甲酯）亚甲基丹参酮Ⅰ (1a): 产率 72%, 紫色粉末。

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 9.30 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.35 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.93 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.60 (dd, J = 8.9, 7.0 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 4.31 – 4.23 (m, 2H), 3.94 (d, J = 13.6 Hz, 2H), 3.46 (s, 2H), 2.74 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 2.61 (s, 3H), 2.33 (s, 3H), 1.39 – 1.27 (m, 4H). ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ 183.57, 175.86, 160.55, 135.24, 133.77, 132.88, 132.85, 130.69, 129.50, 128.41, 124.81, 123.36, 120.93, 119.08, 60.83, 56.79, 50.01, 42.17, 19.88, 14.30, 8.90. ESI-MS m/z: 782.79 [2M+H]⁺ (calculated for C₂₃H₂₁NO₅, 391.14).

15-N-[(S)-2-氨基丙酸甲酯]亚甲基丹参酮Ⅰ (1b): 产率42%,紫色粉末。

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 9.28 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 8.33 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.59 (dd, J = 8.9, 7.0 Hz, 1H), 7.40 (dd, J = 12.3, 7.0 Hz, 1H), 3.93 – 3.81 (m, 2H), 3.77 (s, 3H), 3.52 – 3.47 (m, 1H), 2.73 (d, J = 7.3 Hz, 3H), 2.32 (d, J = 23.1 Hz, 3H), 1.42 (t, J = 7.7 Hz, 3H). ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ 183.50, 175.67, 160.17, 152.11, 135.23, 133.69, 132.86, 130.67, 129.55, 128.35, 124.78, 123.20, 118.93, 118.57, 55.70, 52.05, 41.87, 19.86, 19.13, 8.73. ESI-MS m/z: 782.79 [2M+H]⁺(calculated for C₂₃H₂₁NO₅, 391.14).

15-N-[(S)-2-氨基-3-巯基丙酸乙酯]亚甲基丹参酮Ⅰ(1c): 产率 45%, 紫色粉末。

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 9.30 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.39 – 8.31 (m, 1H), 7.92 (dd, J = 8.7, 3.8 Hz, 1H), 7.61 (dd, J = 8.8, 7.0 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 4.40 – 4.15 (m, 4H), 4.10 (dd, J = 7.3, 4.0 Hz, 1H), 3.86 (dd, J = 51.5, 14.2 Hz, 2H), 3.34 (ddd, J = 18.3, 10.9, 5.7 Hz, 2H), 2.74 (d, J = 8.9 Hz, 3H), 2.40 – 2.31 (m, 3H), 1.38 – 1.30 (m, 3H). ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ 183.87, 175.67, 170.53, 160.61, 150.37, 135.26, 133.79, 132.87, 130.74, 129.40, 128.47, 124.83, 119.02, 100.35 – 99.75, 68.94, 61.60, 58.54, 47.59, 32.79, 19.88, 14.19, 8.92. ESI-MS m/z: 898.42 [2M+Na+H]²⁺ (calculated for C₂₄H₂₃NO₅S, 437.11).

15-N-[(S)-2-氨基-3-苯基丙酸乙酯]亚甲基丹参酮Ⅰ(1d): 产率 58%, 紫色粉末。

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 9.29 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.33 (dd, J = 8.7, 3.9 Hz, 1H), 7.78 (dd, J = 8.7, 4.4 Hz, 1H), 7.59 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 7.45 – 7.37 (m, 1H), 7.28 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.27 (s, 1H), 7.23 (s, 1H), 7.21 (s, 1H), 4.17 (dq, J = 21.4, 7.2 Hz, 2H), 3.92 – 3.75 (m, 2H), 3.52 (dt, J = 63.5, 7.4 Hz, 1H), 3.02 (ddd, J = 21.4, 13.7, 7.0 Hz, 2H), 2.75 (s, 3H), 2.23 (s, 3H), 1.37 – 1.29 (m, 1H), 1.28 – 1.14 (m, 4H). 3C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 183.59, 175.77, 174.09, 160.08, 152.14, 137.05, 135.22, 133.69, 132.82, 130.68, 129.58, 129.17, 128.50, 128.37, 126.87, 124.81, 123.21, 120.94, 118.99, 118.57, 61.70, 60.97, 42.19, 39.71, 29.72, 19.90, 14.20, 8.68. ESI-MS m/z: 962.60 [2M+H]⁺ (calculated for C₃₀H₂₇NO₅, 481.19).

1.2.2 丹参酮IIA衍生物2a-2d的合成

将1.2.1所述合成方法中Tan-I用Tan-IIA替换，其余方法和步骤均相同。四种化合物性状和结构表征如下：

15-N-（2-氨基-乙酸甲酯）亚甲基丹参酮Ⅱ A (2a): 产率 68%, 砖红色粉末。

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.60 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.24 (q, J = 7.2 Hz, 1H), 4.04 (s, 2H), 3.55 (s, 1H), 3.16 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.30 (d, J = 13.3 Hz, 3H), 1.88 – 1.79 (m, 2H), 1.72 – 1.67 (m, 2H), 1.39 – 1.26 (m, 9H). ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ 183.05, 175.45, 170.75, 160.52, 150.31, 150.20, 144.39, 133.45, 126.99, 126.30, 120.44, 120.24, 119.15, 60.75, 54.28, 47.99, 37.83, 34.68, 31.84, 29.89, 19.10, 14.31, 8.89.ESI-MS m/z: 819.03 [2M+H]⁺(calculated for C₂₄H₂₇NO₅, 409.19).

15-N-[(S)-2-氨基-3-甲基丁酸甲酯]亚甲基丹参酮Ⅱ A (2b): 产率 67%, 砖红色粉末。

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.66 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.61 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 3.84 (dd, J = 15.9, 6.6 Hz, 2H), 3.79 – 3.74 (m, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.22 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.06 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 2.26 (s, 3H), 1.86 – 1.80 (m, 2H), 1.72 – 1.68 (m, 2H), 1.35 (s, 6H), 0.97 (dd, J = 6.8, 3.5 Hz, 6H). ¹³C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 183.70, 175.81, 175.17, 160.58, 151.62, 150.05, 144.45, 133.44, 127.39, 126.51, 120.34, 117.79, 66.25, 51.58, 42.77, 37.90, 34.67, 31.85, 31.77, 29.90, 19.18, 19.14, 18.49, 8.71. ESI-MS m/z: 875.02 [2M+H]⁺(calculated for C₂₆H₃₁NO₅, 437.22).

15-N-[(S)-2-氨基-3-巯基丙酸乙酯]亚甲基丹参酮Ⅱ A (2c): 产率69%,砖红色粉末。

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.65 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.23 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.04 (dd, J = 7.3, 4.0 Hz, 1H), 3.80 (dd, J = 49.1, 14.2 Hz, 2H), 3.29 (ddd, J = 18.3, 10.9, 7.2 Hz, 2H), 3.21 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.31 (s, 3H), 1.87 – 1.78 (m, 2H), 1.71 – 1.66 (m, 2H), 1.39 – 1.26 (m, 11H). ¹³C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 183.47, 175.68, 170.54, 161.03, 150.36, 149.47, 144.54, 133.41, 127.14, 126.58, 120.58, 120.32, 119.82, 68.84, 61.53, 58.49, 47.51, 37.85, 34.70, 32.77, 31.85, 29.91, 19.12, 14.17, 8.91. ESI-MS m/z: 957.02 [2M+2Na]²⁺(calculated for C₂₅H₂₉NO₅S, 455.18).

15-N-[(S)-2-氨基-3-苯基丙酸乙酯]亚甲基丹参酮Ⅱ A (2d): 产率 74%,砖红色粉末。

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.69 – 7.63 (m, 1H), 7.54 (t, J = 10.4 Hz, 1H), 7.30 – 7.18 (m, 5H), 4.16 – 4.07 (m, 2H), 3.81 (q, J = 14.7 Hz, 2H), 3.55 (dd, J = 12.6, 5.9 Hz, 1H), 3.25 – 3.17 (m, 2H), 3.08 – 2.96 (m, 2H), 3.05 – 2.95 (m, 2H), 2.21 (s, 3H), 1.84 (ddd, J = 8.9, 7.8, 4.4 Hz, 2H), 1.74 – 1.68 (m, 2H), 1.40 – 1.32 (m, 6H), 1.23 – 1.15 (m, 3H). ¹³C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 183.66, 175.78, 173.99, 160.68, 151.05, 150.13, 144.45, 136.96, 133.38, 129.16, 128.49, 127.28, 126.85, 126.49, 120.46, 118.03, 61.61, 60.93, 42.06, 39.65, 37.89, 34.68, 31.85, 29.91, 19.15, 14.15, 8.67. ESI-MS m/z: 998.92 [2M+H]⁺(calculated for C₃₁H₃₃NO₅, 499.24).

1.3细胞毒性检测

化合物均溶于二甲基亚砜（DMSO）中，终浓度为100 mM，-20℃冰箱内保存，使用时，用无血清培养基稀释至所需浓度，4℃冰箱内保存，两周之内用完。

化合物的细胞毒性用 MTT 法检测，细胞复苏、培养、传代后按照 8000 个/孔的密度加入 96 孔板，终体积为 100 μL。培养 24 h 后吸走培养基，然后加入含有不同浓度（2.5 -50 μM）化合物的培养基，终体积为 200 μL，每个浓度重复 5 个孔。培养24 h后，吸走培养基然后加入100 μL 浓度为 0.5 mg/mL 的 MTT 溶液， 37℃ 继续培养 4 h。 3000 rpm 离心 5 min，弃去上清，每孔加入100 μL DMSO，脱色摇床震荡 10 min 后用酶标仪测定 570 nm 处的吸光度，然后计算每个浓度下的细胞抑制率，使用Graphpad prism计算相应化合物的半抑制浓度（IC₅₀）。

1.4诱导PC12细胞分化

培养PC12细胞到对数期，以10⁵个/mL的浓度接种到6孔板内，细胞贴壁培养过夜。次日，弃去原有完全培养基，随机分为空白对照组（培养基使用DMEM+5% FBS），化合物诱导组（DMEM+5% FBS+ 5 μM化合物）和NGF诱导阳性对照组（NGF组，DMEM+5% FBS+ 50 ng/mL NGF），每个浓度5个复孔。更换相应组别培养基，培养箱内培养5 d, 使用倒置显微镜拍照观察细胞的生长状态及细胞形态变化。将长度超过一个细胞体的神经突出记为阳性细胞，每孔随机选择5个视野，分别计算各组阳性细胞的百分比^15,16。

2 实验结果与讨论

2.1化合物的细胞毒性

化合物1a-1d、2a-2d以及Tan-I、Tan-IIA细胞毒性实验结果如图3所示。Tan-I系列衍生物1a-1d对PC12细胞的毒性存在一定的浓度依赖性，浓度为5 μM时，1c和1d首先表现出细胞毒性，浓度增加到10 μM时，除1b外，其他实验组细胞存活率在50%左右，浓度为20 μM时，细胞存活率下降到30%左右。总体来看，1a-1d的细胞毒性强于Tan-I。Tan-IIA 系列衍生物2a-2d对PC12的细胞毒性较弱，并未表现出浓度依赖性，除化合物2b之外，其他衍生物对细胞的

图3 化合物对PC12细胞的作用，Tan-I及1a-1d（A）, Tan-IIA及2a-2d（B）。

Figure3 The effect of compounds on PC12 cells, Tan-I and 1a-1d（A）, Tan-IIA and 2a-2d（B）。

作用模式与Tan-IIA相似。整体来说，化合物1a-1d的细胞毒性较强，2a-2d的细胞毒性较弱，但是在浓度为5 μM时，所有的化合物均为表现出明显的的细胞毒性。通过计算各化合物对细胞的IC₅₀值（表1），对化合物的细胞毒性定量分析也可以得出相应的结论。根据实验结果可以推测TanIIA及其衍生物2a-2d更具有发挥神经保护作用的潜能。

表1丹参酮氨基酸酯衍生物对PC12细胞的半抑制浓度（IC₅₀）

Table1 The half-inhibitory concentration (IC₅₀) values of derivative on PC12 cells.

Compound		IC50 (μM)
Tan-I				>50
1a				8.839±1.53
1b				12.49±1.86
1c				>50
1d				7.98±1.39
Tan-IIA				>50
2a				>50
2b				>50
2c				>50
2d				>50

2.2化合物诱导的PC12细胞形态变化

为探讨化合物诱导后PC12细胞的形态变化，将空白对照组，化合物处理组和NGF组培养5 d后，使用倒置显微镜观察拍照病统计分析。在化合物作用之前，在完全培养基中，各组未分化PC12细胞形态一致，细胞形态多数呈圆形，体积较小，无突起伸出（图4）。化合物作用5 d后可以发现细胞逐渐开始分化，形态由圆形变为多边形，细胞体积增大，并且由突起伸出，细胞突起逐渐增多并延长，逐步分化为具有神经细胞形态特征的神经元样细胞（图5）。合成的8种衍生物在作用浓度为5 μM时，均表现出了一定的诱导PC12细胞分化的活性。虽然在诱导培养基（DMEM+ 5% FBS）中，对照组（图5L）细胞的形态会发生一定的变化，逐渐由圆形分化为多边形，但细胞突起生长的数量非常少，而且长度较短。与对照组相比，化合物处理组（图5 A-5H）细胞分化程度明显增强，尤其是1a、2b、2c、2d四种化合物，诱导能力明显增强，且比Tan-I（图5I）、Tan-IIA（图5J）的诱导能力更强。对5个随机视野内细胞分化的状况定量分析进一步证实了形态观察所得出的结论（图5M、5N）。

图4 化合物作用下，未分化的PC12细胞状态。(A) 1a, (B) 1b, (C) 1c, (D) 1d, (E) 2a, (F) 2b, (G) 2c, (H) 2d, (I) Tan-I, (J) Tan-IIA, (K) 空白对照。

Figure4 The state of undifferentiated PC12 cells under the action of derivatives. (A) 1a, (B) 1b, (C) 1c, (D) 1d, (E) 2a, (F) 2b, (G) 2c, (H) 2d, (I) Tan-I, (J) Tan-IIA, (K) Control.

NGF诱导PC12细胞后，细胞停止分裂增殖并分化为神经元样细胞，本研究发现合成的丹参酮氨基酸酯衍生物具有NGF类似的诱导功能，衍生物可以使细胞形态发生变化，胞体增大，逐渐伸出突起，进而分化为具有神经元特性的细胞¹⁷。Tan-I系列衍生物以5 μM 浓度作用于细胞时，细胞的分化率与对照组相比大幅提高，表明该系列衍生物具有开发为神经保护类药物的潜力。本研究主要通过细胞形态观察和数据统计得出结论，后续还需要结合生理生化指标的变化进一步印证化合物对PC12细胞的作用效果。

3 结论

神经元细胞的增殖和分化深刻影响了创伤性中枢神经系统损伤后的修复和再生。研发兼具抗神经炎作用和促进神经元存活、分化和再生或增强 NGF 效应，诱导神经突起生长活性的多靶标多功能药物分子是神经退行性疾病治疗的一个重要策略。丹参酮类化合物以其多靶点、多效应的作用方式得到了广泛关注。在本研究中，通过Mannich反应将氨基酸酯连接到丹参酮D环α位，合成了8中

丹参酮氨基酸酯衍生物，并初步测试其细胞毒性以及诱导PC12细胞分化的能力。结果表明，以Tan-IIA为模板合成的2a-2d四种化合物水溶性明显增强，在50 μM

图5 化合物诱导下，PC12细胞的分化状况。(A) 1a, (B) 1b, (C) 1c, (D) 1d, (E) 2a, (F) 2b, (G) 2c, (H) 2d, (I) Tan-I, (J) Tan-IIA, (K) β-NGF，阳性对照，(L) 空白对照，（M）、（N）各组阳性细胞占比。

Figure 5 The differentiation status of PC12 cells under the induction of derivatives. (A) 1a, (B) 1b, (C) 1c, (D) 1d, (E) 2a, (F) 2b, (G) 2c, (H) 2d, (I) Tan-I, (J) Tan-IIA, (K) β-NGF，positive control，(L) Control，（M）、（N） proportion of positive cells in each group.

浓度以下，无细胞毒性，并且5 μM浓度下具有明显的诱导细胞分化的能力。本研究作为探索性实验，只选取了5种代表性的氨基酸酯与Tan-I、Tan-II为原料，合成了8种衍生物，后续还需要结合分子设计等理论合成更多的衍生物，以明确其构效关系，并采用更加多元的方法测定化合物对PC12细胞的作用模式，以期为抗AD药物的研发提供具有研发潜力的先导化合物。

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基金项目：枣庄学院博士启动基金（1020714），枣庄市科技计划（2021GX08）

作者简介：任常霞，女，大学生，天然活性物质筛选。

通信作者：王冬冬，男，博士，讲师，天然活性物质与构效关系研究。

# 共同一作，*通信作者

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