摘 要：目的：用响应面法优化乙醇冷浸提取藏荆芥中E，Z-荆芥内酯的工艺条件，并评价其降血压活性。方法：通过单因素考察，选择乙醇浓度、液料比和提取时间为自变量，E，Z-荆芥内酯转移率为响应值，采用 Box-Behnken 设计试验并进行性响应面法分析，优化冷浸提取工艺。以卡托普利为阳性对照，采用血管紧张素转化酶抑制试验评价E，Z-荆芥内酯的体外降血压活性。结果：优化的最佳工艺为乙醇浓度 91%，液料比 27∶1，提取时间47 h，在该最优条件下得到E，Z-荆芥内酯转移率为99.33%。活性评价结果表明E，Z-荆芥内酯对血管紧张素转化酶抑制率高达91.59%。结论：响应面法优化所得工艺科学合理、切实可行，可用于藏荆芥中E，Z-荆芥内酯的提取。E，Z-荆芥内酯具有较好的血管紧张素转化酶抑制活性，具有开发降血压药物的潜力。
关键词：藏荆芥；E，Z-荆芥内酯；冷浸提取；响应面优化；活性评价
中图分类号：R282
Optimization of cold-soaked extraction technology of E, Z-nepetalactone from Nepeta angustifolia C.Y.Wu by response surface method and evaluation of its activity
Zhang Qin1, Cai Hongfei1,2, He Yingying1, Zhang Zhen1, Mao Yukang1, Yang Yang1, Li Kangqiang1,2, Xu Wendong1,2*
（1.Guangzhou Hanfang Pharmaceutical Company Limited/National Engineering Research Center for Pharmaceutical Process Technology and New Drug Creation of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou, 510240，China；
2. Guangyao Hanfang (Zhuhai Hengqin) Pharmaceutical Company Limited, Zhuhai 519000， China）
Abstract: Objective: To optimize the process conditions for cold soaking extraction of E, Z-nepetalactone from Nepeta angustifolia C.Y.Wu with ethanol using response surface methodology and evaluate its blood pressure lowering activity. Methods: The ethanol concentration, the liquid-material ratio and the extraction time were selected as independent variables by single factor experiment, and the transfer rate of E, Z-nepetalactone was selected as response value. The Box-Behnken design method and response surface methodology were used to optimize the cold-soaked extraction technology. Using captopril as a positive control, the angiotensin-converting enzyme inhibition test was performed to evaluate the in vitro blood pressure lowering activity of E, Z-nepetalactone. Results: The optimal process parameters for optimization are ethanol volume fraction of 91%, liquid to material ratio of 27:1, and extraction time of 47 hours. The transfer rate of E, Z-nepetalactone with the optimal technology was 99.33%. The activity evaluation results indicate that E, Z-nepetalactone has a high inhibition rate of 91.59% on angiotensin-converting enzyme. Conclusion: The extraction technology optimized by response surface methodology was scientific, reasonable, and feasible, and it can be applicable for the extraction of E, Z-nepetalactone from Nepeta angustifolia C.Y.Wu. E, Z-nepetalactone has good angiotensin-converting enzyme inhibitory activity and has the potential to develop antihypertensive drugs.
Keywords: Nepeta angustifolia C.Y.Wu; E, Z-nepetalactone; cold soaking extraction; response surface optimization; activity evaluation
藏荆芥（Nepeta angustifolia C. Y. Wu）是唇形科荆芥属植物，分布于西藏中部及南部地区，是西藏地区独有的植物，其入药部位为地上干燥部分[1]。《藏药晶镜本草》记录了藏荆芥可以治疗中风，创伤肿痛，临床主要用于治疗疮伤及疼痛、神昏惊厥、癫痫、脑溢血等症[2]。现代药理研究发现藏荆芥提取物具有抗炎、镇痛、抗疲劳、耐缺氧、降血糖、抑制酪氨酸酶活性、改善脑出血等功效[3-7]，具有较大的开发价值。藏荆芥主要成分为三萜类、酚酸类、香豆素类等[8-9]，泽仁拉姆等[10]采用GC-MS从藏荆芥的挥发油中鉴定出29种成分，其中主要成分为荆芥内酯，其含量占75%。“荆芥内酯”有4种同分异构体[11]，蔡鸿飞等[12]通过结构鉴定研究发现藏荆芥挥发油中含量占75%的“荆芥内酯”是E，Z-荆芥内酯。活性功效与物质基础息息相关，前期药理研究缺乏药效物质基础分析，其活性是否与E，Z-荆芥内酯有关还有待验证，已有部分研究发现E，Z-荆芥内酯具有缓解化疗药所致神经毒性的功效[13]。
E，Z-荆芥内酯是一种萜类化合物，其提取工艺研究较少，部分学者采用色谱法[14]，仅获得少量样品用于研究，市场上E，Z-荆芥内酯产品也较少，国内暂无厂家生产，国外主要是TRC品牌的对照品在售，价格较为昂贵，可能这也是制约E，Z-荆芥内酯开发应用的主要因素之一。E，Z-荆芥内酯在藏荆芥中含量较高，因此藏荆芥非常适合做提取E，Z-荆芥内酯的原料。E，Z-荆芥内酯易挥发，可通过水蒸气提取藏荆芥挥发油时一起提取出来，但挥发油极易乳化在水中，导致提取转移率较低。因此，本研究拟采用冷浸法提取藏荆芥中E，Z-荆芥内酯，在单因素实验的基础上，采用响应面法优化藏荆芥中E，Z-荆芥内酯冷浸提取工艺，并研究E，Z-荆芥内酯的体外降血压活性，为E，Z-荆芥内酯的工艺研究和藏荆芥药材开发提供数据支持，推进民族医药和中医药现代化发展。
1、仪器与材料
仪器：BSA22AS-CW分析天平；高效液相色谱仪（SPD-10A，岛津）；旋转蒸发仪（型号：RV10，IKA）；药材粉碎机（型号：DFY-500，厂家:温岭市林大机械有限公司）；酶标仪（Synergy LX，安捷伦）；高速离心机（Avanti J-15，贝克曼库尔特有限公司）；紫外可见分光光度计（UV-2600i，岛津）。
材料：藏荆芥药材由西藏广药汉方灵芝产业有限公司提供，经西藏农牧学院兰小中教授鉴定为唇形科植物藏荆芥（Nepeta angustifolia C. Y. Wu），粉碎过二号筛，备用。乙醇、氢氧化钠、氯化钠、乙酸乙酯均为分析纯，广东光华科技股份有限公司；E，Z-荆芥内酯对照品，TRC；硼砂、硼酸均为分析试剂，麦克林；马尿酰-组氨酸-亮氨酸（HHL），HPLC≥98%，麦克林；血管紧张素转化酶（ACE）试剂（≥20 unit/mg），SIGMA；卡托普利（≥98%），麦克林。
2、 实验方法
2.1 E，Z-荆芥内酯冷浸提取
根据《中国药典》2020年版，称取藏荆芥药材粉末4 g，加入100 mL体积的乙醇，冷浸18 h以上，过滤，得E，Z-荆芥内酯冷浸提取液，记录滤液体积，备用。
2.2 E，Z-荆芥内酯含量测定
2.2.1 藏荆芥药材中E，Z-荆芥内酯含量测定
色谱方法[12]：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Supersil ODS2 250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-水(40∶60)为HPLC的流动相，流速为 1 mL/min，色谱柱的柱温为30 ℃，检测波长为216 nm。进样量为20μL。
供试液制备方法：精密称取藏荆芥药材粉末0.1 g，加入50 mL甲醇，超声提取20 min，过滤得滤液，滤渣和滤纸再加甲醇50 mL，同法超声处理5次，合并滤液，40 ℃减压浓缩并转移至25 mL容量瓶中，定容并摇匀，过0.22 μm滤膜，待用。
对照溶液制备：精密称取E，Z-荆芥内酯10 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得到1 mg/mL的溶液。
2.2.2 藏荆芥冷浸提取液中E，Z-荆芥内酯含量测定
取2 mL E，Z-荆芥内酯冷浸提取液，过0.22 μm滤膜，待用。
2.2.3 E，Z-荆芥内酯转移率计算
分别测定藏荆芥药材和冷浸提取液中E，Z-荆芥内酯的含量，并按照以下公式计算E，Z-荆芥内酯转移率。
2.3 冷浸工艺单因素考察
通过单因素实验，分别考察乙醇浓度（20%、40%、60%、80%、95%），料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30）和冷浸时间（4 h、8 h、12 h、24 h、48 h）对E，Z-荆芥内酯转移率的影响。
2.4 响应面实验优化
通过单因素实验结果，确定最佳提取条件为：乙醇浓度为95%，料液比为1:20，冷浸时间为24h。因此，在单因素实验基础上，选取对E，Z-荆芥内酯转移率影响较大的三个因素水平，用响应面设计软件（Design-Expert 8.0.6） 进行Box- Benhnken 试验设计，其中自变量为乙醇浓度（A）、液料比（B）、提取时间（C），每个自变量以低、中、高实验水平进行−1、0、1 编码，响应值为E，Z-荆芥内酯转移率（Y），对E，Z-荆芥内酯的提取方法进行 3因素 3 水平实验，因素水平如表1所示。
表1 因素水平表
Tab.1 Factor level table
序号 | 水平 | 因素 | ||
乙醇浓度% | 液料比 | 冷浸时间h | ||
1 | -1 | 60% | 20 | 12 |
2 | 0 | 80% | 25 | 24 |
3 | 1 | 95% | 30 | 48 |
2.5 体外降血压活性评价
2.5.1溶液配制 用天平称量12.37 g硼酸和19.07 g硼砂，分别用1 L纯化水溶解，用量筒分别取硼砂溶液175 mL和硼酸溶液325 mL，混合均匀，加入少量NaOH调节至pH 为8.3，取17.53 g氯化钠加到溶液中溶解混匀并定容至1 L，得到硼酸盐缓冲液（0.1 moL/L）。取ACE试剂（
2.5.2 酶反应实验 取100 μL HHL溶液（5 mmol/L ）和100 μL供试品溶液混匀，置于37℃水浴锅中，保温5 min；向其中加入10 μL ACE溶液（0.1 U/mL ），在37 ℃的恒温条件下充分反应；反应30 min后，加入150 μL HCl水溶液（1 moL/L）终止反应；然后加入1.5 mL冰乙酸乙酯，混匀并离心5 min，取1 mL酯层于另一试管中烘干1h，烘干温度设为85℃，再加纯化水3 mL溶解，然后测定吸光度（A），检测波长为228 nm。
2.5.3 计算公式 ACE抑制率=（模型组-样品组）/（模型组-阴性对照组）×100%
2.6 数据分析及处理
采用Design-Expert 8.0.6进行响应面优化及分析，采用SPSS23.0进行统计学分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。
3、结果与分析
3.1 单因素实验结果
3.1.1 乙醇浓度 分别称取5份藏荆芥药材粉末，每份4 g，按照乙醇浓度（20%、40%、60%、80%、95%）分别加入，将藏荆芥药材粉末以25∶1 的液料比冷浸提取18 h以上，所得E，Z-荆芥内酯转移率依次为 36.26%、74.32%、81.50%、83.36%、86.99%，随着乙醇浓度升高，E，Z-荆芥内酯转移率不断增加，乙醇浓度为95%时转移率最大。分析可知，当乙醇浓度为从20%增加至60%时，转移率升高约50%，当乙醇浓度为从60%增加至95%时，转移率增加较缓慢，约增加5%。E，Z-荆芥内酯是萜类物质，易溶于乙醇等有机溶剂，可能随着乙醇浓度增加，E，Z-荆芥内酯的溶解逐渐达到饱和。因此，后续选取乙醇浓度 60%、80%、95%进行优化试验。
3.1.2 料液比 分别称取5份藏荆芥药材粉末，每份4 g，按照料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30）分别加入60%乙醇，冷浸提取18 h以上，所得E，Z-荆芥内酯转移率依次为 53.99%、69.25%、71.98%、77.34%、69.06%，E，Z-荆芥内酯含量随着料液比增加先升高后下降，1:25时达到最佳，溶剂增加有利于E，Z-荆芥内酯的溶出，但随着体积增加，其他杂质也会一起溶出，反而影响E，Z-荆芥内酯的溶出，因此，料液比选取1:20、1:25、1:30进行后续优化试验。
3.1.3 冷浸时间 分别称取5份藏荆芥药材粉末，每份4 g，按照料液比1:25加入60%乙醇，分别设置提取时间为4 h、8 h、12 h、24 h、48 h，所得E，Z-荆芥内酯转移率依次为 68.55%、74.93%、75.80%、85.46%、74.79%，E，Z-荆芥内酯含量随着提取时间增加先升高后下降，24h时达到最佳，可能是时间过长导致E，Z-荆芥内酯发生分解，导致提取率减少。因此，提取时间选取 12 h、24 h、48 h 进行后续优化试验。
3.2 响应面优化实验结果
3.2.1 响应面优化实验结果 以乙醇浓度（A）、液料比（B）、提取时间（C）3 个因素为自变量，以E，Z-荆芥内酯转移率（Y）为响应值，对E，Z-荆芥内酯的提取方法进行 3因素 3 水平实验，共计17组，结果如表 2 所示。
Tab.2 Box Benhnken experimental design and results
实验编号 | A/% | B | C/h | Y/% |
1 | 95（+1） | 25（0） | 48（+1） | 97.83 |
2 | 60（-1） | 30（+1） | 30（0） | 76.31 |
3 | 60（-1） | 25（0） | 12（-1） | 87.77 |
4 | 95（+1） | 30（+1） | 30（0） | 98.66 |
5 | 77.5（0） | 30（+1） | 12（-1） | 87.69 |
6 | 77.5（0） | 25（0） | 30（0） | 92.18 |
7 | 77.5（0） | 30（+1） | 48（+1） | 93.44 |
8 | 77.5, （0） | 25（0） | 30（0） | 92.91 |
9 | 95（+1） | 20（-1） | 30（0） | 97.50 |
10 | 60（-1） | 25（0） | 48（+1） | 93.10 |
11 | 77.5（0） | 20（-1） | 48（+1） | 90.07 |
12 | 77.5（0） | 25（0） | 30（0） | 88.89 |
13 | 77.5（0） | 20（-1） | 12（-1） | 92.68 |
14 | 60（-1） | 20（-1） | 30（0） | 88.96 |
15 | 77.5（0） | 25（0） | 30（0） | 92.63 |
16 | 77.5（0） | 25（0） | 30（0） | 93.15 |
17 | 95（+1） | 25（0） | 12（-1） | 97.07 |
3.2.2 方差分析及显著性检验 通过 Design-Expert 8.0.6对表2中数据进行显著性检验分析和方差分析，得到自变量 A、B、C和响应值 Y 之间的二次多项回归方程为Y = 91.95 + 5.62 A - 1.64 B + 1.15 C + 3.45 A B - 1.14 A C + 2.09 B C + 0.69 A2 - 2.28 B2 + 1.3 C2。 该回归模型的显著性检验结果如表3所示，各因素对E，Z-荆芥内酯转移率影响大小为A ＞ B > C，回归方程的一次项 A 对响应值的影响显著，回归模型 F 值为 4.9（P ＜ 0.05，显著），而失拟项的 F 值为 5.32（P ＝ 0.0702 ＞ 0.05，不显著），表明该方程拟合情况较好且具有统计学意义。
Tab.3 Response surface ANOVA analysis results
方差来源 | 平方和 | 自由度 | F值 | P值 |
模型 | 384.28 | 9 | 4.9 | 0.024 |
A | 252.23 | 1 | 28.93 | 0.001 |
B | 21.48 | 1 | 2.46 | 0.1605 |
C | 10.65 | 1 | 1.22 | 0.3056 |
AB | 47.68 | 1 | 5.47 | 0.052 |
AC | 5.22 | 1 | 0.6 | 0.4644 |
BC | 17.47 | 1 | 2 | 0.1998 |
A2 | 2 | 1 | 0.23 | 0.6467 |
B2 | 21.96 | 1 | 2.52 | 0.1566 |
C2 | 7.13 | 1 | 0.82 | 0.3958 |
残差 | 61.04 | 7 | / | / |
失拟项 | 48.8 | 3 | 5.32 | 0.0702 |
误差 | 12.24 | 4 | / | / |
总离差 | 445.32 | 16 | / | / |
图1 各自变量间交互作用对E，Z-荆芥内酯转移率的响应面三维图
Fig.1 Three dimensional response surface plot of the interaction between individual variables on the transfer rate of E, Z-nepetalactone
3.2.3 响应面分析及验证 根据回归方程绘制不同影响因素对E，Z-荆芥内酯转移率的响应面图，该图可直观地反映出各自变量对响应值的影响（图 1）。分析图 1 可知，液料比与乙醇浓度、乙醇浓度与冷浸时间的响应面曲面相对较陡，表明其交互作用对E，Z-荆芥内酯的转移率影响较大，而液料比与冷浸时间的响应面图的曲面较平滑，表明其交互作用对E，Z-荆芥内酯的转移率影响较小。通过软件分析得到E，Z-荆芥内酯转移率的浸提条件为乙醇浓度91.48%、液料比26.97∶1、提取时间46.64 h，预测值为99.06%。结合实际操作情况，确定E，Z-荆芥内酯的最优提取工艺参数为乙醇浓度91%，液料比27∶1，提取时间47 h。在该条件下重复 3次实验，结果显示E，Z-荆芥内酯的转移率分别为99.05%、99.85%、99.09%，平均值为99.33%，验证结果与理论最佳提取率基本一致，表明所得结果准确可靠。
3.3 体外降血压活性评价结果
体外降血压活性评价结果如表4所示，E，Z-荆芥内酯的ACE抑制率高达91.59%，远高于卡托普利（69.36%）。采用SPSS软件对结果进行统计学处理，单因素方差分析P < 0.05时差异有统计学意义，在多重比较（LSD）中，E，Z-荆芥内酯与卡托普利摩尔浓度一致时，E，Z-荆芥内酯的ACE抑制率与卡托普利相比有显著性差异。卡托普利在临床上作为ACE抑制剂（ACEI）类药物治疗高血压，因此，E，Z-荆芥内酯具有制备ACE抑制剂或降压药物的巨大潜力。
表4 ACE抑制率检测结果
Tab.4 Detection results of ACE inhibition rate
组别 | 吸光度（A） | 平均值 | RSD值 | ACE抑制率(%) |
阴性对照 | 0.116 |
0.1167 |
1.10% | / |
0.128 | ||||
0.106 | ||||
模型组 | 0.503 |
0.5170 |
1.28% | / |
0.528 | ||||
0.520 | ||||
卡托普利 | 0.239 |
0.2393 |
0.15% |
69.36 |
0.238 | ||||
0.241 | ||||
E，Z-荆芥内酯 | 0.134 |
0.1503 |
1.56% |
91.59 |
0.152 | ||||
0.165 |
4、讨论
响应面法响应面法能够有效地探索多变量系统中变量之间的相互作用，通过构建响应面模型来描述这些变量的相互作用，被广泛地应用于工艺优化实验中[15-16]。本研究通过单因素考察，用响应面法对E，Z-荆芥内酯的冷浸提取条件进行优化，得到最佳提取工艺参数：乙醇浓度为91%、液料比为27∶1、提取时间47 h，在该条件下，E，Z-荆芥内酯的转移率为99.33%，与建立的模型预测值基本一致，可用于E，Z-荆芥内酯提取。与水蒸气提取法相比，冷浸提取法避免了E，Z-荆芥内酯在热提取过程中与挥发油一起乳化在水中，提高了提取效率，且E，Z-荆芥内酯易溶于乙醇，采用冷浸提取法转移率较高，易操作、成本低，适用于大规模工业化操作。
采用临床上治疗高血压病主要是通过抑制ACE的活性[17]，目前主要采用的ACE抑制剂类药物有卡托普利（Captopril）、赖诺普利（Lisinopril）、依那普利（Enalapril）等，虽可有效降低血压，但是副作用明显，长期服用会造成降压过度、泌尿系统病变、咳嗽、味觉失真及血管神经性水肿等。因此，抑制ACE的天然活性物质的筛选和开发仍是目前研究降血压药物的热点，迄今为止，未见报道“荆芥内酯”任何单体具有抑制ACE酶活性的作用。本研究首次发现E，Z-荆芥内酯的ACE抑制率高达91.59%，具有较强的降血压活性，具有制备ACE抑制剂类降压药物的巨大潜力，但其体内活性及作用机制还有待进一步研究。本研究可为藏荆芥的综合利用和产品开发提供参考。
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