基于响应面与6σ理论的硒多糖螯合工艺优化

　　

基于响应面与6σ理论的硒多糖螯合工艺优化

刘天龙¹，刘红伟²，王鲁波³，王海华^1*，缪锦来^2*

（1青岛海大生物集团股份有限公司，山东 青岛 266109；

2自然资源部第一海洋研究所，山东 青岛 266100）

摘要：

硒多糖是一类通过化学修饰或生物合成方法将硒元素（Se）引入多糖分子骨架的新型有机硒化合物，其结合了多糖的生物相容性和硒的独特生物活性，具有抗氧化、抗炎症、提升免疫力等多重功能，在化工、食品及农业等领域应用广泛。

现行硒多糖工艺中多采用硝酸-氯化钡法化合，对生物体危害性较高，并且可能引起可溶性钡盐对生物体危害。硒多糖研究仍面临结构解析困难、合成工艺不成熟及高剂量毒性风险等挑战。

本方法采用柠檬酸-氯化锶法合成硒多糖，经响应面分析和6σ检验进行优化，最终确定螯合温度为75℃、螯合时间为 6h、酸的添加量为0.1%、催化剂用量0.14（g/100g），经后期检测，有机硒占总硒90%以上。同时，通过3D模型呈现了部分硒多糖可能结构，使其结构更为直观，为多糖类产品开发提供借鉴。

关键词：硒多糖；硒化修饰；响应面分析；6σ检验

Optimization of selenopolysaccharide chelation process based on response surface and 6σ theory

Liu Tianlong¹, Liu Hongwei², Wang Lubo³, Wang Haihua^1*, Miao Jinlai^2*

(1 Qingdao Seawin Biotech Group Co., LTD, Shandong Qingdao 266109;

2 First Institude of Oceanography, MNR, Shandong Qingdao 266100)

Abstract:

Selenopolysaccharides are a new class of organic selenium compounds that introduce selenium (Se) into the molecular skeleton of polysaccharides by chemical modification or biosynthesis, which combines the biocompatibility of polysaccharides and the unique biological activity of selenium, and has multiple functions such as antioxidant, anti-inflammatory, and immune enhancement, and is widely used in chemical, food, and agricultural fields.

Most of the current selenopolysaccharide processes use the nitric acid-barium chloride method of chemosynthesis, which is highly hazardous to organisms and may cause soluble barium salts to be harmful to organisms. Selenopolysaccharide research

收稿日期：2025-03-

基金项目：山东省重点研发计划 (2024TZXD047)；国家自然科学基金（32470132）

作者简介：刘天龙，男，硕士研究生，助理工程师，生物化工。

通信作者：王海华，女，硕士研究生，高级工程师，应用化学；缪锦来，男，博士研究生，研究员，海洋生物资源与利用

is still facing challenges such as difficult structural analysis, immature synthesis process and risk of high dose toxicity.

In this method, selenopolysaccharide was synthesized by citric acid-strontium chloride method, which was optimized by response surface analysis and 6σ test, and the finalized chelating temperature was 75 ℃, the chelating time was 6 h, the addition amount of acid was 0.1%, and the catalyst dosage was 0.14 (g/100 g), and the organic selenium accounted for more than 90% of the total selenium in the post-test. Meanwhile, the possible structures of some selenopolysaccharides were presented by 3D modeling to make their structures more intuitive and provide reference for polysaccharide product development.

Keywords: Selenopolysaccharide; Selenization modification; Response surface analysis; 6σ test

引 言

硒（Se）是人体必需微量元素，在抗肿瘤、抗氧化、免疫调节和抗糖尿病活性方面发挥着重要作用。目前，40多个国家处于低硒和缺硒地区，约有10亿人需要补充硒^[1]。然而，Se无法自身合成，需从外界获取。

自然界中的Se主要以有机和无机两种形式存在，与无机硒相比，有机硒的吸收效果和对人体影响更小^[2]。有机硒可分为以下几类：存在于动植物体内的硒蛋白等天然有机硒；通过生物发酵等过程转化得到的富硒酵母，富硒食用菌等；通过化学合成方法得到的硒代半胱氨酸（Se-Cys）、硒代蛋氨酸（Se-Met）、硒化卡拉胶、硒化多糖等。而其中的硒化多糖是天然多糖硒化修饰而来，是一种新型功能性有机硒化合物，是醛、酮糖组成的聚合物，由糖苷键连接，具有毒性小、副作用低、生物利用度高等优点，与多糖相比，具有诸如抗氧化、抗肿瘤、调节免疫等多种生物活性^[3]，它不仅保持了多糖的活性结构和生物利用度，还发挥了硒的药理作用，提高了二者的生物活性，同时，也避免了多糖分子量较大，不易分解的问题，通过硒化改性也降低大多数多糖的分子量，更易发挥其功能。同时，硒多糖与亚硒酸钠等无机硒相比，不仅兼具硒和多糖的功能，而且作为一种新型有机硒化合物，规避了硒较难吸收这一不足，在清除自由基、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂、清除亚铁离子、调节免疫功能等方面均有优异表现，是不可多得的含硒天然产物。可作为一种良好的补硒剂使用。

经CiteSpace软件对近五年文献进行汇总，并进行关键词的共现、聚类、时间线及是否存在关键词的突变进行分析（图1）表明：1，研究核心集中在硒多糖的化合及抗氧化方面；2，研究方法采用响应面法，硒多糖的提取制备及结构表征上；3，研究热点集中在抗氧化性、免疫活性上。

图1硒多糖文献汇总

Fig.1 Summary of selenopolysaccharide literature

A：共现分析；B：聚类分析；C：时间线及突变分析

在硒含量检测方法中，有机硒中硒含量的检测方法主要包括：原子荧光光谱法（AFS），气相色谱法（GC），电感耦合-等离子体质谱法（ICP-MS），液相色谱-高分辨质谱法（LC-HRMS）等^{[4, 5]}。已有检测方法多集中在对粮谷、酵母等有机硒检测上，因硒多糖中多糖与硒同时存在的高水溶性，导致其难以分离。已有研究对硒多糖中硒含量进行检测，比如经液相色谱-电感耦合-等离子体质谱法HPLC-ICP-MS对硒多糖中的元素硒 (78.37%)、硒-蛋氨酸 (14.27%)、硒代半胱氨酸 (0.03%) 和硒-甲基硒代半胱氨酸 (5.22%)进行了确定^[6]。然而，HPLC-ICP-MS等已有检测方法费时费力，且设备昂贵，在工业化生产中难以与生产相匹配，开发高效准确检测方法迫在眉睫。

因硒多糖化合过程中多采用硝酸、氯化钡等对生物体危害性较大的试剂，使硒多糖在饲料中的应用受到诸多限制。为克服天然硒多糖含硒量低问题，通过磷酸-亚硒酸钠(H₃PO₄-Na₂SeO₃ )法进行硒化修饰，并采用氯化锶（SrCl₂）做催化促进剂，将含硒的功能基团接到多糖分子上，既提高硒多糖中硒含量，又可避免传统硝酸-亚硒酸钠(HNO₃-Na₂SeO₃ )法所带来的生化环境问题。因此，本研究拟采用实验流程如图2所示：通过亚硒酸钠与多糖的有效螯合，可获得粗多糖溶液，经喷粉可得粗硒多糖粉；或经进一步离心、透析等得较纯硒多糖。

图2 拟采用工艺流程

Fig.2 Proposed process flow

1仪器与材料

1.1 实验材料：

多糖酶解液：总糖（以鼠李糖计）≥20%，固形物含量≥25%；柠檬酸（一水）；亚硒酸钠（纯度≥98%）；SrCl₂等催化剂。

1.2 实验方法：

以多糖酶解液为研究对象，优选硒多糖最佳螯合工艺，硒螯合率经Uv-Vis法进行检测。以硒多糖中硒螯合率为响应值，通过Box-Behnken中心组合法设计3因素3水平实验，重点探究螯合温度、螯合时间、催化剂用量3个因素对硒多糖中硒螯合率的影响。

1.3 分析测试仪器与试剂：

UV-1800型紫外分光光度计，普析；pH计，上海雷磁仪器厂。

水为GB/T 6682中规定的三级水；浓硝酸；高氯酸；浓盐酸；EDTA-2Na；邻苯二胺；甲苯；亚硒酸钠标准品：纯度≥98%

10g/L EDTA-2Na（≥99%）溶液：准确称取1g（精确至0.0001g）EDTA-2Na，用水溶解并定容至100mL，摇匀，备用。

1mol/L 盐酸溶液：移取37%浓盐酸（ρ=1.18）8.3ml，用水溶解并定容至100mL容量瓶中，摇匀，备用。

10g/L 邻苯二胺溶液（临用前配制）：准确称取1g（精确至0.0001g）邻苯二胺，用水溶解并定容至100mL容量瓶中，摇匀。

1g/L 硒标准储备液：准确称取亚硒酸钠1.0952g（精确至0.0001g），用水溶解并定容至100mL容量瓶中，摇匀，备用。

2 实验结果与讨论：

2.1 单因素水平

根据UV-Vis法测得不同浓度硒溶液吸光度值，以硒质量浓度和吸光度值分别为横、纵坐标绘制标准曲线（图3）。分别以酸度、不同催化剂、温度、时间、催化剂添加量为单因素，以硒螯合率为评价指标，各单因素结果如图4。分别采用不同催化剂，评估硒化后溶液浑浊度及固体粉末状态（图5）。

由单因素实验可知，酸的添加量对硒螯合率无显著影响；选用钡离子或锶离子做催化剂，对硒螯合率无显著性差异，但均高于不加催化剂时；单因素时间、温度、催化剂SrCl₂添加量分别为6h、70℃、0.13%时，各单因素条件下硒螯合率达到最高。

考虑到工艺稳定性、后续生产实际需要，以及SrCl₂提升免疫力作用，重点考察温度，反应时间，以及催化剂SrCl₂的添加量对硒螯合率的影响。

图3硒溶液标准曲线

Fig.3 Selenium solution standard curve

图4 硒螯合率单因素实验结果

Fig.4 Selenium solution standard curve

A：酸添加量的影响；B：不同催化剂的影响；C：不同时间的影响

D：不同温度的影响；E：催化剂添加量的影响

图5 不同催化剂宏观对比

Fig.5 Macro comparison of different catalysts

A：催化剂氯化锶；B：催化剂硝酸锶；C：催化剂氯化钡

D：催化剂氯化钙；E：催化剂硝酸钡。

2.2 PB和最陡爬坡实验

由四个单因素所有范围，得到实验设计。经进一步硒螯合率实验，得到不同因素对硒螯合率的影响效果（即，t值）。在所有单因素中，催化剂、反应时间、反应温度均起正向作用，由单因素同时结合帕累托图（图6），酸的添加量对硒螯合率影响并不显著。因此，确定硒多糖螯合温度(A)、螯合时间(B)、催化剂（C）为主效因素，做最陡爬坡实验，在各因素条件下，确定包含最优值的各因素范围（表1）。

图6 帕累托图

Fig.6 Pareto chart

表1 最陡爬坡实验因素范围

Tab.1 Steepest climb experimental factor range

序号	酸	催化剂	反应时间	反应温度	螯合率
1	0	0.07	4	65	78.86
2	0.3	0.1	6	72.5	85.31
3	0.6	0.13	8	80	94.19

2.3 响应面因素水平

依据单因素实验结果可以确定硒多糖螯合温度(A)、螯合时间(B)、催化剂用量(C) 3个因素的最佳条件，从而建立响应面分析因素水平，如表2所示。

表2 响应面分析因素水平

Tab.2 Response surface analysis factor levels

水平	A/℃	B/h	C/( g·g-1)
-1	65	4	0.07
0	72.5	6	0.10
1	80	8	0.13

2.4 回归模型建立与分析

总共需要进行17次实验，其中包括中心点的重复测定。用Design-Expert软件给出17组实验设计，其中分析原因的实验12次，中心组合实验需要重复5次，响应面的实验设计如表2所示。通过对表2的数据进行拟合得到模型方程，即硒多糖螯合率(Y)的计算公式，如下:

Y=95.23+0.23A+0.57B+0.73C+0.16AB+0.027AC

+0.35BC-4.42A²-2.61B²-0.21C²

其中，Y表示硒多糖螯合率(%)，A表示螯合温度(℃)，B表示螯合时间(h)，C表示催化剂用量(g·g^-1)。

表3 响应面实验结果

Tab.3 Response surface experiment results

编号	A/℃	B/h	C/(g·g-1)	螯合率/(%)
1	80	4	0.1	87.46
2	65	8	0.1	88.61
3	80	8	0.1	89.08
4	65	6	0.07	89.32
5	80	6	0.07	90.04
6	65	6	0.13	91.1
7	80	6	0.13	91.93
8	72.5	4	0.07	91.72
9	72.5	8	0.07	92.02
10	72.5	4	0.13	92.11
11	72.5	8	0.13	93.79
12	72.5	6	0.1	93.24
13	72.5	6	0.1	93.74
14	72.5	6	0.1	93.71
15	72.5	6	0.1	97.74
16	72.5	6	0.1	97.74
17	80	4	0.1	87.46

从公式中可以看出，AB、AC、BC的交互作用与硒多糖螯合率都呈现正相关。一般由交互作用系数大小可以判断硒螯合率影响大小;根据回归方程可以看出，交互作用影响大小依次为BC＞AB＞AC。

2.5 回归模型方差分析

回归模型的方差分析见表3。由表3可知：整体模型的P值＜0.03，符合P＜0.05，说明该方程模型较好；模型的失拟项P=0.9905，不符合P＜0.05，说明失拟项影响不大，模型选择符合实际情况；模型的校正决定系数R²（adj）（0.8534>0.80）且变异系数（CV）为1.91%，说明该模型有14.66%的变异可由该模型进行解释，进一步说明模型拟合优度较好，与实际实验的拟合情况较好，可以对硒多糖工艺制备研究进行初期分析及预测。通过F值可以得出各因素对硒多糖螯合率的影响大小依次为：C＞B＞A。

为同时监测温度、时间、催化剂对反映过程影响，进一步评估模型中17个样本的T²-广义方差控制图（图7）。这两个控制图在中心值处随机变化，均低于控制上限，表明变异受控。同时，样本13-15表现出特异性。

表4硒多糖中有机硒螯合率的方差分析

Tab.4 Analysis of variance (ANOVA) of the chelation rate of organic selenium in selenopolysaccharides

因素	平方和	自由度	均方	F值	P值	显著性
模型	125.92	9	13.99	4.53	0.0295	显著
A	0.42	1	0.42	0.14	0.7237
B	2.6	1	2.6	0.84	0.3895
C	4.25	1	4.25	1.38	0.2792
AB	0.11	1	0.11	0.035	0.8564
AC	3.03E-03	1	3.03E-03	9.79E-04	0.9759
BC	0.48	1	0.48	0.15	0.7063
A2	82.38	1	82.38	26.67	0.0013
B2	28.7	1	28.7	9.29	0.0186
C2	0.19	1	0.19	0.062	0.8105
残差	21.62	7	3.09
失拟项	0.53	3	0.18	0.034	0.9905	不显著
纯误差	21.09	4	5.27
总误差	147.54	16

图7 T²（A）及广义方差（B）分析

Fig.7 T² (A) and generalized variance (B) analysis

2.6 三维响应面分析

三维响应面分析各因素两两交互作用的等高线图和三维响应面如图8～10所示。 等高线形状越接近椭圆形，说明各因素交互作用越显著；等高线形状越接近圆形，说明交互作用越不显著。由图8～10可知，AB、AC、BC的交互作用等高线都比较接近圆形，表明影响效果不显著这与方差分析结果一致。

图8 催化剂用量和时间的交互作用

Fig.8 Interaction of catalyst dosage and time

图9 催化剂用量和温度的交互作用

Fig.9 Interaction of catalyst dosage and temperature

图10 温度和时间的交互作用

Fig.10 Interaction of temperature and time

2.7 最佳工艺条件预测与6σ检验

基于6σ理论，对17个样本的有机硒螯合率进行统计：设定硒螯合率标准90%（图11A），各散点值（图11B）均大于86%范围内分布，根据影响有机硒螯合率的交互作用分析（图11C）、主效应分析（图11D）、响应面法建立的模型及各因素交互等值线分析（图12）可以预测出硒多糖最佳合成工艺条件是:合成温度为72.5℃、合成时间为6 h、催化剂用量0.13（g/100g)，此条件下硒多糖螯合率的预测值为93.61%。

对17个样本的BBD过程进行正态性、CpK及Z过程能力分析（图13），并进一步汇总于过程能力6σ评估（图13）中，P=0.421(>0.05)，即有机硒螯合率符合正态分布，所有样本均分布于90%左右。由Cp和CpK可知过程输出无偏移，1.00＞CpK≥0.67，表明该有机硒螯合工艺可以实施，但尚有改进空间。另，可以预计的是，若未对工艺做进一步改进，进行批量生产，每100万个硒多糖样品中，约有12318个样品硒螯合率小于85%，9057个样品的硒螯合率大于99%，即不合格率大于1%。

图11 有机硒螯合率与标准的散点分布图（A）、单值分布图（B）、交互作用图（C）、主效应图（D）

Fig.11 Scatterplot of organic selenium sequestration rate versus standard (A), single-value distribution (B), interaction plot (C), main effect plot (D)

图12 螯合率与温度、时间、催化剂等值线图

Fig.12 Chelation rate vs. temperature, time, catalyst contour plots

图13 正态性（A）、CpK（B）及Z（C）检验

Fig.13 Normality (A), CpK (B) and Z (C) tests

图14 过程能力6σ评估

Fig.14 Process capability 6σ assessment

根据实际操作的可行性对预测条件稍微调整:合成温度为75℃、合成时间为 6h、酸的添加量为0.1%、催化剂用量0.14（g/100g）。在调整后的合成条件下进行3次平行实验，以减小误差，最终测得硒多糖硒螯合率的平均值为94.72%。这与模型的预测值比较接近，说明优选后的硒多糖合成工艺和建立的模型可靠、预测性较好，有一定的参考价值。

2.8 样品检测

硒多糖螯合后进行喷粉，在硒多糖喷粉过程中的1h和2.5h分别取样，对所取样品螯合率等进行评估，所得数据如表6所示。样品外观呈现棕褐色粉末状固体，极易溶于水，有机硒螯合率为＞90%（图16）。

表6 硒多糖样品检测

Tab.6 Polysaccharide Pilot Sample Assay

检测项目	指标	实测值
总糖（以鼠李糖计）	≥20%	28.79
总硒	≥0.2%	0.254
有机硒占总硒质量百分比	≥90%	95.911
水分	≤10%	1.89

图15 样品评估

Fig.15 Post-Pilot Sample Evaluation

A：硒多糖中硒含量评估；B：有机硒占总硒百分比；

C：中试后浒苔硒多糖粉。

2.9 硒多糖与酵母硒比较

如图16，通过比较可以发现，自产硒多糖（有机硒螯合率95.6%）＞竞品酵母硒（有机硒螯合率92.17%），同时，硒多糖表现出良好的水溶性。

图16 硒多糖与酵母硒比较

Fig.16 Comparison of selenopolysaccharide with yeast selenium

A：硒含量柱状图；B：酵母硒中有机硒占比；C：硒多糖中有机硒占比。

2.10 硒多糖3D结构模型构建

经Gaussian软件，对多糖分子进行三维模型构建（图17）。多糖分子（图17A₁）主要由鼠李糖、葡萄糖醛酸和木糖组成，通过β(1-4)糖苷键连接，并于鼠李糖的C-3位含有一个带负电的硫酸盐基团（图197A₁、A₂红色虚线圆圈所示）。当多糖分子与亚硒酸钠中四价硒在前述温度、时间条件下，经催化螯合后，多糖中单糖硫酸鼠李糖2号位上的硫酸根可能部分被四价硒取代变成硒酸酯基团（图17B₁、B₂红色虚线圆圈所示），进而生成硒多糖（图17B）。

图17 浒苔多糖与硒多糖分子模型构建

Fig.17 Molecular modeling of polysaccharides and selenopolysaccharides in seabird moss (Phyllostachys edulis)

A₁：多糖分子3D结构；A₂：多糖分子2D结构模型；

B₁：硒多糖分子3D结构；B₂：硒多糖分子2D结构模型。

黑色、红色虚线圆圈所示为关键结构位点变化。

3 结论

天然硒多糖中含硒量低，不能满足日常化工、饲料的添加需求，本方法所生产的硒多糖中硒含量高（>90%），与亚硒酸钠等无机硒相比对生物更为友好。

现行硒多糖工艺中多采用硝酸-氯化钡法化合，一方面采用对生物存在高危险性的硝酸的加入，另一方面，氯化钡作为可溶性钡盐在后续饲料等生产中也会造成在生物体内累积。本方法采用生物安全性更高的柠檬酸，同时，采用具有提免作用的氯化锶做催化剂，对硒多糖的合成更为友好。

（1）本方法生产的多糖硒中，有机硒占总硒的百分比可达90%以上。

（2）天然硒多糖中含硒量低，不能满足化工、食品、饲料的添加需求，现行硒多糖工艺中多采用硝酸-氯化钡法化合，这一方面采用对生物存在高危险性的硝酸的加入，另一方面，氯化钡作为可溶性钡盐在后续饲料等生产中也会造成在生物体内累积。本方法采用生物安全性更高的柠檬酸，同时，采用具有提免作用的氯化锶做催化剂。

（3）采用氯化锶做催化剂，避免了氯化钡等重金属的添加，给生物体造成重金属累积。而且，在多糖硒本身具有的提高免疫、抗炎等功效的同时，又兼具锶的提免功效，在化工、饲料中将具有更为广泛的应用。

总之，本方法所生产的硒多糖中硒含量高（>90%），满足化工、饲料添加剂要求，同时，解决了生产喷粉中硒多糖久置沉淀，造成喷粉不佳的问题。

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