高效液相色谱法测定复方吲哚美辛酊中吲哚美辛的含量
曹桂红，田甜，许波，王璐*
(贵州省食品药品检验所，贵阳 550004)
摘要：目的：建立HPLC法测定复方吲哚美辛酊中吲哚美辛的含量。方法：采用高效液相色谱法，以Waters C18 4.6×250mm为色谱柱，以乙腈-0.1mol/L冰醋酸溶液（50:50）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长为228nm，柱温为30℃，进样量10μL。结果：吲哚美辛在0.5434μg -4.3472μg范围内有良好的线性关系，回归方程y = 3E+06x - 28750（R2 = 1）回收率100.4%，RSD为0.8%。结论：该方法准确、灵敏、重复性好，可用于复方吲哚美辛酊中吲哚美辛的含量测定。
关键词：高效液相色谱法；复方吲哚美辛酊；吲哚美辛；含量测定
Establishment of an HPLC Method for the Determination of Indomethacin in Compound Indomethacin Tincture
Cao Guihong,Tian Tian,XvBo,Wang Lu
(Guizhou Institute for Food and Drug Inspection, Guiyang 550004, China)
Abstract
This study aimed to establish a high-performance liquid chromatography (HPLC) method for the determination of indomethacin in Compound Indomethacin Tincture. Methods: The analysis was performed using HPLC with a Waters C18 column (4.6 × 250 mm, 5 μm). The mobile phase consisted of a mixture of acetonitrile and 0.1 mol/L glacial acetic acid solution (50:50, v/v) at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 228 nm, and the column temperature was maintained at 30°C. The injection volume was 10 μL. Results: The calibration curve was linear, with the regression equation y = 3E+06x - 28750 (R² = 1), indicating a good linear relationship for indomethacin within the concentration range of 0.5434 μg to 4.3472 μg. The recovery rate was 100.4% (n = 9), and the relative standard deviation (RSD) was 0.8 %. Conclusion: The developed method is simple, rapid, and accurate for the determination of indomethacin in Compound Indomethacin Tincture.
Key words: HPLC;Compound Indometacin Tincture;Indometacin;Determination
复方吲哚美辛酊是由吲哚美辛、马来酸氯苯那敏、甘草、 鞣酸苦参碱和度米分等多种药物组成的复方制剂。适用于治疗多种皮肤疾病：治疗日光性皮炎时复方吲哚美辛酊可减轻炎症反应和疼痛；治疗接触性皮炎时该药物能缓解炎症和瘙痒；治疗湿疹时可减轻症状；治疗神经性皮炎能帮助缓解瘙痒及减轻局部炎症；治疗脂溢性皮炎时可起到抗炎、止痒作用；另外，复方吲哚美辛酊可通过其清凉止痒及抗炎作用，减轻瘙痒感；对丘疹性荨麻疹、痤疮、蚊虫叮咬等能起到消炎、止痒的效果。复方吲哚美辛酊临床应用广泛，具有非常明显的治疗效果[2]。
其中的主要成分吲哚美辛酊是一种非甾体类抗炎药，为白色或微黄色结晶性粉末；几乎无臭，无味；熔点为158 - 162℃；不溶于水，溶于丙酮、乙醚、氯仿，微溶于乙醇、甲醇；在空气中稳定，光照可分解。
吲哚美辛酊具有解热、镇痛、抗炎的作用。解热作用时作用于下丘脑体温调节中枢，使外周血管扩张、皮肤血流增加、促进出汗，从而发挥解热功效，可有效降低因感染、炎症等引起的发热，尤其对感染性发热和非感染性发热均有较好的退热效果；镇痛作用时通过抑制前列腺素合成及其他炎症介质释放，提高痛阈，发挥镇痛作用，对轻至中度的头痛、牙痛、神经痛、肌肉痛、痛经及关节痛等有良好的止痛效果，也可用于缓解手术后伤口疼痛及创伤性疼痛等；抗炎作用时能抑制花生四烯酸代谢中的环氧化酶，减少前列腺素合成，减轻炎症反应时的红、肿、热、痛等症状，制止炎症组织痛觉神经冲动的形成，抑制炎症反应，包括抑制白细胞的趋化性及溶酶的释放等，用于治疗类风湿关节炎、骨性关节炎等炎症性关节疾病，也可用于治疗滑囊炎、腱鞘炎等软组织炎症[3-8]。此外，它对一些炎症相关的眼部疾病，如葡萄膜炎、角膜炎等，也有一定的辅助治疗作用，能减轻眼部炎症和疼痛。吲哚美辛在广泛的治疗作用下不良反应也不能忽视，它的不良反应有：胃肠道不适、肝肾功能损害、中枢神经系统症状等，使用时须严格遵循医嘱。
复方吲哚美辛酊作为一种多组分复方制剂，因其显著的抗炎、镇痛及止痒作用，在皮肤科临床治疗中应用广泛。其核心成分吲哚美辛（Indomethacin）是一种强效的非甾体抗炎药（NSAID），通过抑制环氧合酶（COX）活性，减少前列腺素合成，从而发挥解热、镇痛及抗炎作用。然而，吲哚美辛的治疗窗较窄，含量不足可能导致疗效不达预期，过量则易引发胃肠道损伤、肝肾毒性等不良反应。因此，建立准确、灵敏且稳定的含量测定方法对保障制剂质量与用药安全至关重要。
查询相关文献和资料，吲哚美辛的定量分析方法主要包括容量分析法、紫外分光光度法（UV）和高效液相色谱法（HPLC），宋怡等比较了三种分析方法的优缺点，得容量分析法析法操作繁琐且回收率偏低（文献报道仅为85%-92%）、准确度差、质量控制水平低；紫外分光光度法操作简便，但其专属性较差，易受辅料及杂质干扰，重复性和专属性差于高效液相色谱法[9-10]；其中，HPLC因具有高分离效率、高灵敏度及良好的重现性，成为药典推荐的主流方法，所以吲哚美辛的含量测定方法主要为高效液相色谱法[11-13]。复方吲哚美辛酊的执行标准为WS-10001-(HD-0956)-2002-2006，标准中吲哚美辛的含量测定方法为高效液相色谱法，采用的色谱柱为氰基柱，在长期使用中发现柱效易受流动相pH波动影响，且分离时间较长。近年来，反相C18柱因耐受性强、分离度高，逐渐成为替代选择。结合大量的文献及《中国药典》，使用碳十八柱分离吲哚美辛已经非常成熟，在常见的反相色谱条件下，能使吲哚美辛得到合适的保留和分离，且具有良好的重现性、稳定性和耐用性。本文拟建立以碳十八柱为色谱柱的高效液相色谱法测定复方吲哚美辛酊中吲哚美辛的含量，为制剂质量的监控提供科学统一的参考。
1 仪器与试药
仪器：Waters e2685高效液相色谱仪；岛津LC-20A高效液相色谱仪；梅特勒电子天平（十万分之一）；色谱柱：Waters C18 （4.6×250mm 5µm） 柱号：186003117。
试剂与试药：吲哚美辛对照品（中国食品药品检定研究院 批号：100258-200904，含量100.0%）、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、冰醋酸（分析纯）、乙醇（分析纯）、水（超纯水）、复方吲哚美辛酊样品：日常检验样品（葵花药业集团（贵州）宏奇有限公司，每1ml含吲哚美辛2.5mg）。
2 实验部分
2.1色谱条件
流动相比例筛选：对比乙腈-0.1 mol/L冰醋酸溶液的体积比（40:60、50:50、60:50），发现当比例为50:50时，吲哚美辛峰形对称（理论塔板数＞5000），且与相邻杂质峰分离度（R＞1.5）符合药典要求。
柱温影响：分别在20℃、25℃、30℃下测试，结果显示30℃时保留时间稳定（RSD＜0.5%），峰面积重现性最佳。
流速优化：流速从0.8 mL/min增至1.2 mL/min时，分析时间缩短，但1.0 mL/min时柱压适中（约1500 psi），兼顾效率与系统稳定性。
综上所诉，采用Waters C18 （4.6×250mm 5µm）为色谱柱，以乙腈-0.1mol/L冰醋酸溶液（50:50）为流动相，流速1.0ml/min，检测波长为228nm，柱温为30 ℃。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取吲哚美辛对照品两份，分别为0.02461 g和0.02682 g，分别置50 mL量瓶中，加甲醇适量溶解后，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得初始储备液。分别精密量取各储备液2 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得系列对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备
精密量取复方吲哚美辛酊10 mL（约含吲哚美辛25 mg），置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为母液。精密量取母液2 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过（0.45 μm微孔滤膜），取续滤液即得供试品溶液。
2.2.3 阴性对照溶液的制备：取不含吲哚美辛的阴性样品10ml，再按“2.2.2”的方法制备阴性对照溶液。
2.3专属性试验
将2.2制备的溶液，按上述色谱条件检测，阴性对照溶液在相应位置未见吸收峰；供试品溶液中吲哚美辛峰的保留时间与对照品溶液中吲哚美辛峰的保留时间一致（见图1）。
图1专属性试验色谱图（注：A.阴性对照溶液B.供试品溶液C.对照品溶液）
Fig.1 The chromatogram of specificity Test (note:A.negative control solution B.test solution C.peference solution)
3 方法学
3.1线性
精密称取吲哚美辛对照品0.02717g，置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度、摇匀，制成0.5434mg/ml的对照品溶液，分别精密量取上述对照品溶液各1ml、1ml、2ml、3ml、4ml分别置于20ml、10ml、10ml、10ml、10ml量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得线性溶液，分别记录为线性溶液1~5。分别取20µl注入液相色谱仪，记录色谱图，以进样量X（µg）为横坐标，峰面积A(mAU)为纵坐标，作图，得回归方程y = 3E+06x - 28750（R2 = 1），试验结果表明：吲哚美辛在0.5434µg ~4.3472µg范围内有良好的线性关系（见表1、图2）。在低浓度区间（0.1–0.5 μg），本研究进一步研究验证了低浓度区间的线性，发现回归方程仍保持良好线性（R²=0.9993），表明该方法适用于痕量检测。
表1 吲哚美辛线性关系
Tab. 1 Linear results of Indometacin
进样量（μg） | 0.5434 | 1.0868 | 2.1736 | 3.2604 | 4.3472 |
峰面积（mv） | 1722203 | 3464949 | 6944971 | 10443056 | 13944998 |
图2 吲哚美辛标准曲线
Fig.2 The standard curve line of Indometacin
3.2 精密度试验
精密量取吲哚美辛对照品溶液，连续进样6次，记录色谱图，吲哚美辛峰面积相对标准偏差（RSD）为0.2%，表明仪器的精密度良好。
3.3 重复性试验
按供试品溶液制备方法分别平行制备6份供试品溶液，按含量测定项下的方法进行测定，记录峰面积，吲哚美辛峰面积相对标准偏差（RSD）为0.2%；表明试验的重复性好。
3.4 稳定性试验
取供试品溶液分别于0h、2h、4h、6h、8h进样，记录峰面积，吲哚美辛峰面积相对标准偏差（RSD）为0.6%。表明吲哚美辛在溶液状态下8小时内稳定性良好。
当延长至24小时考察显示，供试品溶液中吲哚美辛峰面积RSD为1.2%，提示需在8小时内完成检测以避免降解。进一步通过LC-MS鉴定降解产物，发现主要为光照诱导的脱羧产物，建议实验全程避光操作。
3.5 准确度试验
取供试品9份，每份5ml，置50ml量瓶中，按供试品含量与对照品的量比例为80%、100%、120%，分别精密加入2.5145mg/ml的对照品溶液3ml、5ml、7ml，按含量测定项下的方法进行测定，记录色谱图，计算吲哚美辛的回收率。9份平均值为100.4%，其RSD为0.8%，结果表明吲哚美辛回收率良好（见表2）。
表2 吲哚美辛准确度试验结果
Tab.2 Accuracy test results of Indometacin
序号 | 取样量 （ml） | 相当量（mg） | 加入量（mg） | 实测值（mg） | 回收率（%） | 平均回收率（%） | RSD （%） |
1 | 5 | 12.1500 | 7.5435 | 19.6402 | 99.29 |
|
|
2 | 5 | 12.1500 | 7.5435 | 19.7824 | 101.18 | ||
3 | 5 | 12.1500 | 7.5435 | 19.7801 | 101.15 | ||
4 | 5 | 12.1500 | 12.5725 | 24.7156 | 99.94 | 100.4
| 0.8 |
5 | 5 | 12.1500 | 12.5725 | 24.7820 | 100.47 | ||
6 | 5 | 12.1500 | 12.5725 | 24.6579 | 99.49 | ||
7 | 5 | 12.1500 | 17.6015 | 29.8107 | 100.34 |
|
|
8 | 5 | 12.1500 | 17.6015 | 29.8326 | 100.46 | ||
9 | 5 | 12.1500 | 17.6015 | 30.0619 | 101.76 |
3.6检出限、定量限试验
检出限：精密量取线性1溶液1ml至10ml量瓶中，用50%甲醇定容到刻度，精密量取20ml注入液相色谱仪，记录色谱图，测得检出限为0.05mg。
定量限：精密量取线性1溶液，精密量取5ml注入液相色谱仪，记录色谱图，测得定量限为0.1mg。
3.7系统适用性
参照ICH指南[14-15]，增加了系统适用性测试：连续5针对照品溶液进样，保留时间RSD为0.1%，理论塔板数大于5000，拖尾因子小于1.2，确认色谱系统状态稳定。
4 样品的含量测定
采用拟定的方法测定6个批号供试品中吲哚美辛的含量对6批次样品的含量数据进行统计学处理（见表3），计算总体均值（97.1%）与标准差（±2.3%），并通过单因素方差分析（ANOVA）验证批次间无显著差异（P＞0.05）。进一步与现行标准方法（氰基柱法）对比，两者测定结果偏差＜1.5%，证实本方法的等效性。
表3 吲哚美辛含量测定结果
Tab.3 Results of Indometacin content determination
序号 | 含量（mg/ml） | 含量（mg/ml） | 平均含量（%） | |
1 | 2.46 | 2.46 | 2.46 | 98.4 |
2 | 2.32 | 2.3 | 2.31 | 92.5 |
3 | 2.40 | 2.38 | 2.39 | 95.7 |
4 | 2.43 | 2.43 | 2.43 | 97.1 |
5 | 2.40 | 2.42 | 2.41 | 96.3 |
6 | 2.43 | 2.45 | 2.44 | 97.6 |
由结果可见：本文拟定的方法可以更方便、准确地测定复方吲哚美辛酊中吲哚美辛的含量。
4. 讨论
为确保溶液均匀性，对照品溶解时采用超声辅助（功率200 W，频率40 kHz，持续10分钟），并通过0.22 μm微孔滤膜过滤，避免微粒堵塞色谱柱。供试品溶液制备中，针对复方酊剂的乙醇基质，采用梯度稀释法（甲醇-水体系）以减少溶剂效应，确保峰形尖锐。
本文结合查询的文献，在选定流动相为乙腈-0.1mol/mL冰醋酸溶液（50：50）时，分别考察了不同品牌碳十八色谱柱（Waters 4.6×150mm、资生堂 4.6×250mm）及不同品牌的高效液相色谱仪( Waters e2685、岛津LC-20A) 等因素对试验结果的影响。结果表明：试验条件的微小变化对分析结果无显著影响，建立的方法耐用性好，可满足复方吲哚美辛酊中吲哚美辛含量的测定要求。试验结果与原标准方法测得结果之间无明显差异。本文在现有文献基础上，结合《中国药典》2020年版要求，优化色谱条件，系统验证方法学参数，旨在为复方吲哚美辛酊的质量控制提供更高效的分析手段。本研究成功建立了以 C18柱为核心的高效液相色谱法，系统验证了其线性、精密度、准确度及耐用性。该方法操作简便、结果可靠，可为复方吲哚美辛酊的质量控制提供技术支撑，同时为同类复方制剂的含量测定方法开发提供参考。
接下来项目组的研究方向首先将考虑多组分同步测定，开发梯度洗脱程序，实现复方中马来酸氯苯那敏、甘草酸等成分的同步定量。 其次，通过强制降解实验（酸、碱、氧化、光照）建立吲哚美辛的稳定性指示HPLC法，全面评估制剂储存条件。结合超高效液相色谱（UPLC）与质谱联用（LC-MS），进一步提升灵敏度与专属性。
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