我国生物法生产丙烯酰胺技术概论
张弓
（安徽天润化学工业股份有限公司，安徽 蚌埠 233010）
[作者简介：张弓（1979.10-），男，出生地：安徽阜阳，毕业于安徽理工大学、安徽财经大学，双本科学历，化学工程与工艺工程师，现主要从事聚丙烯酰胺工程、工艺及应用技术研究工作，zgxl8@163.com]
摘要：丙烯酰胺（Acrylamide，简称AM）是丙烯酰胺系中最重要、最简单的一种，用途十分广泛，可用作有机合成的原料及高分子材料的原料，主要用于生产有“百业助剂”“工业味精”和“万能产品”之称的聚丙烯酰胺。因此，研究当今第三代工业化生物法生产丙烯酰胺技术十分必要。本文首先介绍了丙烯酰胺工业化技术发展历程，其次陈述了我国生物法生产丙烯酰胺工业化技术，再次对我国生物法丙烯酰胺生产用腈水合酶的研究进行概述，最后提出当前我国生物法丙烯酰胺工业化生产中存在的主要问题。基于上述分析，展望今后国内生物法生产丙烯酰胺工业化技术的研究方向。
关键词：生物法；丙烯酰胺；腈水合酶
丙烯酰胺用途十分广泛，主要用来生产聚丙烯酰胺，应用于石油开采、造纸、水处理、选矿等行业，具有絮凝、增稠、降阻和粘合功能。生物法生产丙烯酰胺，因腈水合酶（NHase）催化效率高、反应条件温和、产物品质高、环境友好等优点，作为第三代工业化生产丙烯酰胺技术已替代铜系催化剂催化水合法，当前业内此法生产技术已较为成熟。
1 丙烯酰胺工业化技术发展历程
1893年德国学者Moureu通过丙烯酰-氯氨化法合成AM获得成功。但是工业上都是使用丙烯腈（AN）水合来生产AM的，其方法有三种：
1.1 硫酸催化水合法：1954年，美国氰氨公司开发出硫酸催化合成AM技术，推动了其工业化进程，在此后近20年时间内一直是唯一的AM工业化生产技术，但其流程复杂，设备腐蚀严重，产品精制困难，对环境污染也严重。
1.2 铜系催化剂催化水合法：上世纪70年代初，日、美同期开发出铜系催化剂催化合成AM技术，此法在70年代中期基本取代硫酸法。与硫酸法相比，产品纯度及转化率均有很大的提高，流程短且腐蚀小，环境污染也较少。本法又分为固定床催化水合法和悬浮床催化水合法。固定床催化水合法以美国道化学公司为代表，采用Cu-Cr催化剂，该法具有催化剂易活化、易再生的特点，系统全封闭；悬浮床催化水合法以日本三菱化成公司和三井东压公司为代表，采用Cu-Ni催化剂，该法催化剂可连续再生、补充，反应稳定，但设备结构复杂、工艺流程长。
1.3 微生物酶催化水合法：始于1973 年，法国学者Galzy等发现了能催化水解的微生物Brevbacterium R312，可用于催化合成AM。1985年日东化学公司采用自行选育的Rhodococcus sp. N-774建立了产能为4000吨/年的试生产装置；1988年京都大学山田秀明教授研发团队选育的Pseudomonas chlororaphis B23应用于工业化生产丙烯酰胺，1992年选育出酶活性更高的R.r J1菌种，使AM生产规模提升至万吨级，R.r J1是微生物法生产AM的第三代生物催化剂。在上世纪90年代中期，我国也成功独立开发出微生物法生产AM工业化技术。微生物法与铜催化法相比较，生产丙烯酰胺具有如下优势：反应条件较为温和，在常压、20-30℃下即可催化反应，过程相对简单，且提高了生产安全性；AN单程转化率高达99.6%以上，省去了AN回收工段，AN单耗也较低；水合产物AM浓度较高，可达30%-55%范围内，省去了AM蒸发浓缩工段；AM产品纯度高，不含铜离子，对生产高分子量的水溶性聚丙烯酰胺特别有利；蒸汽消耗、水消耗、废水排放量均相对较少；经济效益明显高于铜催化法。
2 我国生物法生产丙烯酰胺工业化技术
2.1 第一代工业化技术：由上海农药研究所在“八五”科技攻关期间开发的“离心分离细胞+固定化细胞催化反应+离心分离产物”工艺，其工业化应用单位有：浙江桐庐汇丰、江苏南天、江西昌九、河北万全和山东胜利油田长安实业等公司。
2.2 第二代工业化技术：由上海农药研究所在“九五”科技攻关期间开发的“离心分离细胞+游离细胞催化反应+超滤膜分离产物”工艺；其工业化应用单位有：北京恒聚和山东胜利油田长安实业等公司。
2.3 第三代工业化技术：引进世界领先的Suntar公司产具有高强度、高抗污染等特点的Ultra-floTM膜系统，开发出“微滤膜分离细胞+游离细胞催化反应+超滤膜分离产物”的连续化生产工艺，早期工业化应用单位有：吉化集团环保实业和大庆油田东昊实业等公司。当前，此“双膜分离提取法”技术已发展成为生物法生产丙烯酰胺的主流工艺，所选用的中空纤维膜，材质为聚偏氟乙烯，在单位体积膜组件中有效膜面积最大，结构简单，分离效率高，操作方便，易于清洗，价格低廉，不产生二次污染等优点，含腈水合酶菌体收率＞98%，远高于第一、二代工业化技术中的离心分离方法。
基于生物法生产AM的诸多优势，当前国内工业化生产AM的方法几乎均采用生物法技术，提取精制采用“双膜法-离子交换”工艺。目前，我国生物法生产AM的第三代工业化技术经过多年的改良与优化，在产能规模和工艺技术方面均位于世界前列。
3 我国生物法丙烯酰胺生产用腈水合酶的研究概述
我国研究生物法生产丙烯酰胺用腈水合酶（NHase）始于1984年，最早的有上海农药研究所、中国科学院微生物研究所、山东省科学院生物研究所、上海交通大学、北京石油化工科学研究院等单位，工业化应用技术的先行者为上海农药研究所，后期加入的科研单位主要有清华大学、江南大学，国内有关腈水合酶的科研成果见表1。
1986年上海农药研究所沈寅初院士科研团队成功从泰安地区土壤中筛选到一株腈水合酶高产菌诺卡氏菌Nocardia sp.86-163，该菌株与国内报道最多的红球菌Rhodococcus sp.系列菌株，如R.r J1等同为诺卡氏菌类，但不同均属，该所的微生物法生产AM研究课题，被国家科委列为“七五”、“八五”与“九五”国家科技攻关项目，并先后顺利通过验收。后历经5年3次攻关，成功选育了高产酶量的优良微生物菌种，从而研究成功了微生物催化法生产丙烯酰胺的一整套高产、高效的生物催化产业化技术。该技术首先在浙江桐庐汇丰公司中试成功。建立了我国第一套利用生物催化技术生产大宗化工原料的工业化装置，开创了生物催化大规模生产大宗化学品的先河，此后该技术在全国迅速推广。
表1 我国有关研究腈水合酶的科研单位及主要研究成果表
序号 | 科研单位 及主要研究人员 | 主要研究成果 |
1. | 上海农药研究所 沈寅初等 | 1986年，筛选出一株高产的腈水合酶Nocardia sp.86-163，通过诱导将其酶活提高至5627.5U/mL。 |
2. | 上海交通大学 孙韦强等 | 1988年，筛选出的NHase产生菌Pseudomonas putida JP-1和Pseudomonas chlororaphis 102 。利用其催化水合4h后的AM的累积量＞21.5%，转化率＞99%。 |
3. | 中国科学院微生物研究所 李文忠等 | 1990年，发表文献并报道了丁腈同化菌ZBB-21为棒状杆菌且具有很高的AM形成活性。利用其催化水合4.5h后，AM的累积浓度为270g/L。 |
4. | 江南大学、江苏昌九农科化工有限公司 周哲敏、刘中美等 | 2018年，通过蛋白质工程技术改造提升腈水合酶催化性能，构建出高效表达腈水合酶的重组基因工程菌，其菌酶活达到4000u/mL、发酵周期为48h、产品AM浓度达40%，分别是野生菌R.r J1的1.8倍、50%、1.1倍。 |
5. | 浙江大学 杨立荣、杨正飞 | 2018年，进一步系列研究：将来源于Aurantimonas manganoxydans SI85-9A1的NH08克隆并构建在重组大肠杆菌中，使激活蛋白的表达量提高了5.14倍，酶活达到120U/mL；将β亚基的表达量提高了33%，酶活达到160U/mL,比酶活达到1531.2U/mL。最后在15L罐中发酵，酶活达到9080 U/mL。 |
6. | 江南大学 周哲敏、程中一等 | 2019年，通过基因融合技术，提高腈水合酶的热稳定性。以L-NHase为研究对象，将高热稳定的加帽蛋白TERM融合到L-NHase的C端，得到新的融合型腈水合酶，该酶可在50℃条件下处理20min残余酶活仍保持80%以上，远高于野生型的40%。 |
7. | 清华大学 刘铭、李春、高毅等 | 2004年，主要研究在极端环境下，提高现有菌种Nocardia sp. RS对AM难受性的方法。通过在菌体生长、筛选和酶催化高产物AM耐受性菌体三个过程耦合时加入AN生成AM来强化其对产物AM的耐受性，最终筛选出在152.5g/L AM浓度下仍可存活的RS-1菌株。利用其催化生产的AM浓度为587.1g/L。 |
8. | 清华大学 高毅、刘铭、曹竹安 | 2005年，研究了影响酶失活和腈水合酶反应速率的因素。实验证明PH值的变化基本不影响酶反应速率；底物AN的浓度＜10g/L时，酶反应速率与底物浓度成正比，＞75g/L后，对酶有抑制作用；产物AM显著对酶有抑制作用；胞内的NHase在40℃下的半衰期为59.9h；温度与AM的协同作用是NHase失活的重要原因。 |
9. | 清华大学 孙云鹏、于慧敏、孙旭东等 | 2010年，研究建立了游离细胞NHase催化AN水合反应的双稳态反应动力学模型，关联了产物浓度、底物浓度和温度等主要因素对反应速率的影响。 |
10. | 清华大学 于慧敏、焦松、沈忠耀 | 2017年，从酶层次和细胞层次对常用的生产菌株性能改造策略进行概述；通过对R.ruber TH 在细胞和酶层面的协同改造，重组游离细胞TH8实现了工业化约500g/L浓度AM产品的制备。 |
11. | 江南大学 崔文璟、张赛兰等 | 2020年，在基因库中挖掘潜在的耐热型NHase基因，最终筛选出温泉热碱芽孢杆菌（Cal.thermarum TA2.A1, ）的NHase的基因，再经过基因合成、密码子优化等技术手段，获得电泳纯目的蛋白。该Cal.t NHase在60℃条件下处理7h的残余酶活为53.3%，催化烟腈的比酶活为395U/mg；根据Cal.t NHase中βHis150在该酶热稳定性中所起的关键作用，将工业生产所用的R.r J1来源的H-NHase的β亚基相对应的150位点（βAsn154）突变为His，其热稳定性得到提升，比酶活提高了50.0%。 |
12. | 江南大学 张赛兰、李婷、程中一等 | 2020年，研究以提高腈水合酶热稳定性为出发点，从美国国立生物技术信息中心通过BLAST筛选到一种新型耐热NHase，该酶来源于温泉热碱芽孢杆菌（Cal.thermarum TA2.A1），该菌株最适生长温度为65-70℃，并将该酶的基因序列进行密码子优化，基因合成后再大肠杆菌BL21（DE3）宿主中异源表达。 |
13. | 江南大学 周哲敏、程中一、张苇苗等 | 2021年，采用分子动力学模拟的方法，研究Cal.thermarum TA2.A1得到了最优突变体βN47F,催化AN的比酶活力较野生型酶提高了3.57倍，且酶活提高至592.92±9.57U/mg；对含有pRSFDuet-1-BA质粒的重组大肠杆菌进行5L发酵罐发酵培养34.50h后菌体量达到OD600=130.40，且具有良好的热稳定性，为工业化应用奠定了坚实基础。 |
14. | 江南大学 周哲敏、钟先平、江诗进 | 2022年，研究Cal.t NHase获得具有更高催化性能的最优突变体Cal.tNHase-αA20V/βL48H，该突变体催化烟腈的酶活是野生酶的4.1倍，在65℃下的半衰期为2h，产物烟酰胺的半抑制浓度为48.3%（W/V）；将含pET-24a(+)-Cal.tNHase-αA20V/βL48H质粒的重组大肠杆菌在5L发酵罐中发酵培养24.5h，菌体OD600=110.0，催化烟酰胺的酶活为6805U/mL，较R.r J1发酵周期更短且产酶量更高。 |
15. | 江南大学 周哲敏、郭军玲 | 2023年，聚焦现有NHase的改造和新型NHase的挖掘。以P.p -NHase 为研究对象，构建亚基融合型P.p NHase ，其最佳突变体P.p NHase -A8 在50℃下半衰期是野生型的7.7倍，表现出更高的比酶活和稳定性；挖掘到极端奢热链霉菌C.t NHase，其在60℃下的半衰期为265min，是目前报道的最稳定的NHase，其突变体βL48D催化烟腈的比酶活是野生菌的7.7倍；挖掘到高盐环境下的奢盐古细菌A.r NHase，通过异源表达，在4.0M底物处理后，该酶酶活仍能保持89.14%；在4.0M产物处理后，该酶酶活让能保持97.52%，均明显高于其它来源的NHase。 |
随着国内聚丙烯酰胺产能的不断扩大，相应对丙烯酰胺的需求也不断增加，国内学者在NHase产生菌株的分离选育、菌株特性研究、NHase的形成条件等方面做了大量的工作。近年来，对NHase的结构和性质进行了深入研究, 从分子水平上揭示了NHase的催化机理, 这些性质的深入研究对提高酶的催化活性、稳定性都有重要的意义。
4 我国生物法生产丙烯酰胺存在的主要问题
4.1有待进一步提升腈水合酶的稳定性和酶活。
腈水合酶的稳定性主要体现在：耐热性、对底物产物浓度的耐受性方面。当前，国内工业生产中腈水合酶的稳定性普遍较差，一般情况下，催化水合耐受温度＜30℃，基本上控制在20-30℃范围内；国内生物法水合工序产品AM浓度一般在30%左右，与日本产腈水合酶催化水合工序产物浓度50%还有较大差距，NHase容易失活，含其菌体悬浊液生产中循环使用5次后需要更换；另外，当前工业用含腈水合酶菌株难以驯化，容易出现性能返原问题。当前，国内工业化发酵腈水合酶酶活水平总体上在1000×10 4ug/ml.hr左右，相同菌种在不同工况下的酶活差别较大，仍有较大提升空间。实际工业化生产中仍存在：游离细胞催化水合过程中生成少量的AA；部分生产菌株在发酵过程中发生絮凝现象；胞内NHase受到添加的AN和高浓度产物AM抑制作用以及水合反应温度波动的影响，其酶活迅速下降等诸多问题。
4.2有待进一步提升工业化装置的工程技术水平。
当前业内水合等关键工序的中间品质检基本都采取人工、间歇取样质检方式，生产控制不易，生产过程波动大，工作效率低，同时易造成安全、环保问题；当前较先进的通用型发酵罐有效容积为15m3、25m3、催化水合釜有效容积为30m3；典型的“水合-双膜法提取、树脂离交精制”工艺中基本上均采用间歇运行方式，能耗高、人工成本高、产品质量难以稳定。
5 我国生物法生产丙烯酰胺工业化技术研究方向展望
5.1 进一步提升腈水合酶的稳定性和酶活
微生物法生产丙烯酰胺的关键是制备腈水合酶，如何让腈水合酶在长时间的循环利用中仍能保持高度的酶活性，提高其循环使用次数尤为重要。若能通过基因工程、酶反应的调控机理和降低装置对菌种的剪切力等方面深入研究，提高腈水合酶菌体的使用周期，将可降低原辅料、能源消耗，减少废水排放量，进而大幅提供经济效益。
可探索从基因库中筛选，并利用生物信息学、蛋白质工程及基因组测序、融合技术、挖掘技术等手段，通过亚基融合策略来提高现有高活性NHase的稳定性；挖掘极端奢菌株和奢盐菌株来源的NHase，获取高稳定性和高耐受性NHase，并通过半理性改造提高活性，以及利用基因工程从细胞层面和酶层面协同改造、重组细胞，最终获得稳定高的高性能NHase。
5.2进一步提升工业化工程技术水平。
探索催化水合连续化生产工艺；进一步验证、推广水合过程质检近红外在线检测系统（NIR系统）实现实时检测、反馈水合釜中的AN与AM浓度水平，进而实现生产的稳定性；探索工业化生产中采用紫外光谱法实时测定NHase含量，以便控制NHase的添加比例与更新；探究AM精制装置阴阳离子柱匹配与组合方式，以提高连续化、稳定化水平；结合行业发展及装置产能规模，适度放大关键反应罐釜有效容积，实现规模效益。总之，不断探索新的工艺、提升装置技术水平（其中含循序渐进、适度放大发酵罐、水合釜等关键设备有效容积，并优化结构）等，不断提升生产的稳定、连续、自动化水平，进而提升产品经济效益，促进行业发展。
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Introduction to Biological Production Technology of Acrylamide in China
ZHANG GONG
（Anhui Tianrun Chemicals Co,.Ltd, Anhui University, Bengbu 233010, China)
Abstract:Acrylamide (AM) is the most important and simplest type of acrylamide, with a wide range of applications. It can be used as a raw material for organic synthesis and polymer materials. It is mainly used to produce polyacrylamide, which is known as a "versatile additive", "industrial monosodium glutamate", and "universal product". Therefore, it is necessary to study the third-generation industrial biological method for producing acrylamide today. This article first introduces the development process of industrial technology for acrylamide, then describes the industrial technology for producing acrylamide through biological methods in China, and provides an overview of the research on nitrile hydratases used in the production of acrylamide through biological methods in China. Finally, the main problems in the current industrial production of acrylamide through biological methods in China are pointed out. Based on the above analysis, we look forward to the research direction of industrial technology for the production of acrylamide by biological methods in China in the future.
Key words: Biological method ；Acrylamide ；NHase
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